ПЛАН
доклинических исследований ТТС на основе алпразолама для лечения заболеваний нервной системы и пограничных состояний
ТТС с алпразоламом,
трансдермальная терапевтическая система, ХХ мкг/час
План доклинического изучения препарата ТТС (трансдермальная терапевтическая система) с алпразоламом разработан в соответствии с рекомендациями ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств, Москва 2012), национального стандарта РФ «Принципы надлежащей лабораторной практики лекарственных препаратов для медицинского применения» (Утверждены приказом Минздрава РФ № 000н) предусматривает изучение общетоксического действия исследуемого препарата (п. п. ТII-3.-ТII-4.), общей фармакологической активности, влияния на сердечно-сосудистую систему и дыхание (п. п. ТII-8.), специфической анксиолитической активности и подтверждения механизма действия алпразолама в трансдермальной форме (п. п. ТII-5.-ТII-7.), изучение толерантности и возможной лекарственной зависимости (п. п. ТII-6.) и фармакокинетики препарата (п. п. ТIII-3.)
В основу расчета доз изучаемой ТТС для лабораторных животных положен процент площади их терапевтических доз от общей площади поверхности тела человека. Так, ТТС рекомендуется для человека в терапевтической дозе равной 25 - 50 см2, что составляет 0,14% от общей площади поверхности тела «стандартного» человека. Расчет доз приведен в таблице 1.
Таблица 1 Расчет доз
Вид | «Стандартный» человек | Крыса | Мышь | Кролик | Морская свинка |
Общая площадь поверхности тела, см2 | 18100 (1,0) | 291 (0,016) | 73,3 (0,0002) | 1240 (0,068) | 480 (0,026) |
Масса, г | 70 000 (1,0) | 200 (0,0029) | 20 (0,0002) | 1500 (0,021) | 400 (0,006) |
Терапевтическая доза ТТС, см2 | 25 (0,14%) | 0,5 (0,17 % ) | 0,25 (0,34 %) | 2,0 (0,16 %) | 0,7 (0,14 %) |
Максимальная доза (площадь аппликации) ТТС, см2 | 300 (1,65%) | 8,0 (2,75 %) | 4,0 (5,45 %) | 16,0 (1,29 %) | 6,0 (1,25%) |
План протокола изучения токсичности препарата
Т1I-3. Исследование токсичности и переносимости ТТС с алпразоламом при однократной аппликации лабораторным животным (мыши, крысы, кролики) («острая токсичность и безопасность»)
Исследования будут проведены на нелинейных половозрелых мышах и крысах (самцы и самки) для определения ЛД50.
На первом этапе этих исследований для определения ориентировочной ЛД50 препарат будет апплицироваться отдельным животным (по 3 особи) в максимально возможных дозах (площадях) на 48 часов, затем препарат будет сниматься. При отсутствии летальности (невозможности установить ЛД50) на втором этапе исследований препарат будет назначаться группам животных (по 6 мышей и крыс в каждой) в дозах меньших, равных и превышающих ориентировочную терапевтическую дозу.
Длительность периода наблюдения за животными после аппликации – 4 дня, в течение которых будет проводиться учет погибших и выживших животных, расчёт ЛД50. Должно проводиться клиническое наблюдение всех групп животных с описанием возможных симптомов (ежедневно), определяться масса тела (фон, 2-е и 4-е сутки). В случае гибели животных должно проводиться гистологическое исследование внутренних органов.
Фиксируют общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер их двигательной активности, координации движений, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, состояние шерстного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, положение хвоста, прирост массы тела, потребление пищи и воды. Местнораздражающее действие в месте аппликации оценивают сразу после снятия ТТС, через 24 часа и на 4 сутки (визуальный осмотр), Реакцию кожи на раздражение оценивают по шкале, разработанной . Регистрируют следующие показатели в бальной системе: 0 – видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии; 2 - ярко - розовая эритема по всему участку или по его периферии ; 3 - красная эритема по всему участку ; 4 - инфильтрация и отек кожи ( утолщение кожной складки ) при наличии или отсутствии эритемы; 5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъявления (некроз) возможны геморрагии, образование корочек.
На 4-е сутки наблюдения для выживших животных проводится некропсия, макроскопическое описание внутренних органов и расчёт массовых коэффициентов внутренних органов.
Исследование переносимости препарата при однократной аппликации планируется провести на кроликах Шиншилла (масса тела 2,0-3,0 кг). Препарат ТТС с алпразоламом будет наклеен однократно в максимально возможной для аппликации площади (40 см2).
До введения препарата, через 24 часа и 48 часов после аппликации препарата, и через 24 часа после снятия ТТС будут исследоваться гематологические показатели крови: количество эритроцитов, гематокрит, уровень гемоглобина, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и их процентное соотношение, количество и средний объем тромбоцитов. В сыворотке крови животных в те же сроки будут определяться следующие биохимические показатели: общий белок, мочевина, креатинин, глюкоза, общий холестерин, триглицериды, общий билирубин, активность сывороточных аспартат - и аланинаминотрансфераз, щелочной фосфатазы и лактатдегидрогеназы. На протяжении эксперимента будет регистрироваться общее состояние и поведение животных.
Местнораздражающее действие в месте аппликации оценивают сразу после снятия ТТС, через 24 часа и на 4 сутки (визуальный осмотр), Реакцию кожи на раздражение оценивают по шкале, разработанной . Регистрируют следующие показатели в бальной системе: 0 – видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии; 2 - ярко - розовая эритема по всему участку или по его периферии ; 3 - красная эритема по всему участку ; 4 - инфильтрация и отек кожи ( утолщение кожной складки ) при наличии или отсутствии эритемы; 5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъявления (некроз) возможны геморрагии, образование корочек.
По изменению указанных тестов, характеризующих систему кроветворения, основные виды обмена, функциональное состояние важнейших органов и систем организма подопытных животных будет проводиться оценка токсического действия препарата.
ТII-3. Исследование токсичности ТТС с алпразоламом при трехкратной аппликации лабораторным животным (мыши, крысы) («суб-хроническая токсичность»)
Исследования будут проведены на нелинейных половозрелых мышах и крысах (самцы и самки). ТТС с алпразоламом определенной площадью наносится аппликационно на выбритый участок кожи спины или у основания хвоста через сутки после процедуры удаления шерсти у животных со здоровой кожей. Фиксирование ТТС проводится гипоаллергенным пластырем с подложкой из хлопчатобумажного материала. Через 48 часов ТТС снимается, место аппликации промывается теплой водой, просушивается ватным тампоном без усилия, и проводится аппликация новой ТТС на новый участок, на старое место аппликации ТТС можно апплицировать только через 48 часов. При исследовании суб-хронической токсичности будет проведен курс из трех последовательных аппликаций препарата.
Должно проводиться клиническое наблюдение всех групп животных с описанием возможных симптомов (ежедневно), определяться масса тела. В случае гибели животных должно проводиться гистологическое исследование внутренних органов.
Фиксируют общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер их двигательной активности, координации движений, реакцию на тактильные, болевые, звуковые и световые раздражители, состояние шерстного и кожного покрова, окраску слизистых оболочек, положение хвоста, прирост массы тела, потребление пищи и воды. Местнораздражающее действие в месте аппликации оценивают сразу после снятия ТТС, и через 24 часа и 48 часов (визуальный осмотр). Реакцию кожи на раздражение оценивают по шкале, разработанной . Регистрируют следующие показатели в бальной системе: 0 – видимой реакции нет; 1 - бледно-розовая эритема по всему участку или по его периферии; 2 - ярко - розовая эритема по всему участку или по его периферии ; 3 - красная эритема по всему участку ; 4 - инфильтрация и отек кожи ( утолщение кожной складки ) при наличии или отсутствии эритемы; 5 - эритема, выраженная инфильтрация, очаговые изъявления (некроз) возможны геморрагии, образование корочек.
На 10-е сутки наблюдения животных декапитируют, проводится некропсия, макроскопическое описание внутренних органов и расчёт массовых коэффициентов внутренних органов.
ТII-4- ТII-8. Изучение хронической токсичности ТТС с алпразоламом на крысах. Изучение общей фармакологической активности, влияние на сердечно-сосудистую систему и дыхание
После завершения адаптационного периода и снятия фоновых гематологических и биохимических параметров, а также массы тела у крыс Wistar, будут сформированы следующие группы животных (разделенные на 2 подгруппы каждая, самцов и самок):
- 1 группа – контроль, 2 группа – ТТС с алпразоламом, предполагаемая терапевтическая доза для человека (1,0 см2), 3 группа – ТТС с алпразоламом, предполагаемая высшая терапевтическая доза для человека (4,0 см2).
Аппликация препарата будет вводиться животным в указанных дозах каждые 48 часов в течение 90 дней. Контрольные животные будут получать аппликации соответствующие количества гипоаллергенного медицинского пластыря на хлопчатобумажной основе.
На протяжении эксперимента будет отмечаться общее состояние и поведение животных (динамика массы тела, двигательная активность, аппетит, состояние шерстного покрова). Динамические исследования гематологических и биохимических показателей будут проведены до начала исследования, через 1 месяц и после окончания действия последней ТТС. В указанные сроки в цельной венозной крови будут исследованы следующие гематологические показатели: количество эритроцитов, гематокрит, уровень гемоглобина, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и их процентное соотношение, количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов. В сыворотке крови в эти же сроки будут определяться следующие биохимические показатели: общий белок, билирубин, мочевина, креатинин, глюкоза, общий холестерин, триглицериды. а также активность щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, аспартат - и аланинаминотрансфераз. Гематологические исследования будут проводиться на анализаторе Abacus Junior Vet (Австрия), биохимические - на анализаторе Таrgа-2000 (Италия).
Физиологические исследования частоты сердечных сокращений и параметры электрокардиографии (ЭКГ) во II отведении без наркоза на ЭКГТ будут проведены до начала исследования и через 14 дней, 30 дней, 60 дней и через 90 дней назначения препарата.
Также будет оцениваться влияние препарата на частоту дыхания животных до начала эксперимента и через 14 дней, 30 дней, 60 дней и через 90 дней после первого применения препарата.
Функцию выделительной системы будут исследовать по следующим показателям: спонтанный диурез за 18 часов, удельная масса мочи весовым методом, рН мочи.
После окончания хронического эксперимента будет проведена эвтаназия крыс с последующим патоморфологическим (макро - и микроскопическим) исследованием их внутренних органов. Вскрытие животных будет проведено сразу же после их гибели, по полной патологоанатомической схеме, что исключает возможный аутолиз тканей и позволяет проводить дополнительные исследования. Для патоморфологического исследования образцы свежей ткани будут зафиксированы в 10% нейтрализованном растворе формалина для получения в последующем парафиновых срезов толщиной в 4-5 мкм. Обезвоживание, обезжиривание, проводка и заливка тканей в парафин с воском будут проведены в микропроцессорных автоматах «Leica» ТР 1020 EG 1150 (Германия) по заранее составленным программам. Микротомирование парафиновых блоков тканей будет осуществляться с помощью санного (Россия) и ротационных (Райхерт, Австрия; АО-820, США) микротомов, что позволит получить серийные срезы. После депарафинирования срезы будут окрашены гематоксилин-эозином и другими азокрасителями в автоматической системе «Leica» ST 5010, заключены в пихтовый бальзам под покровные стекла и приготовлены для визуального просмотра. Микроскопия будет проведена на микроскопе Nikon Eclipse E-200.
Для изучения местнораздражающего действия после завершения эксперимента место аппликации препарата должно быть подвергнуто гистологическому исследованию с полным описанием образцов.
ТII-8. Изучение общей фармакологической активности, влияния на сердечно-сосудистую систему и дыхание ТТС с алпразоламом на кроликах Шиншилла
После завершения адаптационного периода, снятия фоновых гематологических и биохимических показателей и массы тела у кроликов, будут сформированы следующие группы животных (разделенные на 2 подгруппы каждая, самцов и самок):
- 1 группа – контроль, 2 группа – 5-кратная предполагаемая высшая терапевтическая доза для человека (10 см2). 3 группа –10-кратная высшая терапевтическая доза для человека (20 см2).
Лекарственная форма препарата будет апплицироваться (наноситься) животным каждые 48 часов (попеременно на разные участки кожи) в указанных дозах в течение 1 месяца. На протяжении эксперимента будет отмечаться общее состояние и поведение животных (динамика массы тела, аппетит, двигательная активность, состояние шерстного покрова). Динамические исследования гематологических и биохимических показателей будут проведены до начала и через 1 месяц назначения препарата.
До введения и через месяц после назначения препарата в цельной венозной крови животных будут исследованы следующие гематологические показатели: количество эритроцитов, гематокрит, уровень гемоглобина, средний объем эритроцитов, среднее содержание гемоглобина в эритроците, общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, гранулоцитов и их процентное соотношение, количество и средний объем тромбоцитов. В сыворотке крови в эти же сроки будут определяться следующие биохимические показатели: общий белок, билирубин, мочевина, креатинин, глюкоза, общий холестерин, триглицериды. а также активность щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, аспартат - и аланинаминотрансфераз. Гематологические исследования будут проводиться на анализаторе Abacus Junior Vet, биохимические - на анализаторе Таrgа-2000.
Физиологические исследования частоты сердечных сокращений и параметры электрокардиографии (ЭКГ) во II отведении без наркоза на ЭКГТ будут проведены до начала исследования и через 14 дней и через 1 месяц назначения препарата.
Также будет оцениваться влияние препарата на частоту дыхания с наркотизацией животных до начала эксперимента и через 15 дней и через 1 месяц после применения препарата.
После окончания хронического эксперимента будет проведена эвтаназия кроликов с последующим патоморфологическим исследованием их внутренних органов. Вскрытие животных будет проведено сразу же после их гибели, по полной патологоанатомической схеме, что исключает возможный аутолиз тканей и позволяет проводить дополнительные исследования. Для патоморфологического исследования образцы свежей ткани будут зафиксированы в 10% нейтрализованном растворе формалина для получения в последующем парафиновых срезов толщиной в 4-5 мкм. Обезвоживание, обезжиривание, проводка и заливка тканей в парафин с воском будут проведены в микропроцессорных автоматах «Leica» ТР 1020 EG 1150 (Германия) по заранее составленным программам. Микротомирование парафиновых блоков тканей будет осуществляться с помощью санного (Россия) и ротационных (Райхерт, Австрия; АО-820, США) микротомов, что позволит получить серийные срезы. После депарафинирования срезы будут окрашены гематоксилин-эозином и другими азокрасителями в автоматической системе «Leica» ST 5010, заключены в пихтовый бальзам под покровные стекла и приготовлены для визуального просмотра. Микроскопия будет проведена на микроскопе Nikon Eclipse E-200.
План доклинических исследований фармакологической активности препарата
ТII-6. Исследование толерантности и возможной лекарственной активности ТТС с алпразоламом
Планируется оценить потенциальные риски возникновения толерантности и возникновения лекарственной зависимости препарата с помощью ряда методов, включенных в качестве обязательных тестов (метод оценки развития синдрома отмены, условно-рефлекторная реакция предпочтения места, оценка двигательной активности).
ТII-5 - ТII-7 - ТII-8. Изучение двигательной активности крыс после применения препарата ТТС с алпразоламом
Оценка двигательной активности крыс будет проводиться на следующих группах животных (самцов):
- 1 группа – контроль, 2 группа – ТТС с алпразоламом, предполагаемая терапевтическая доза для человека (1,0 см2), 3 группа – ТТС с алпразоламом, предполагаемая высшая терапевтическая доза для человека (4,0 см2).
Аппликация препарата будет вводиться животным в указанных дозах каждые 48 часов в течение 1 месяца. Контрольные животные будут получать аппликации соответствующие количества гипоаллергенного медицинского пластыря на хлопчатобумажной основе. Через 1 месяц применения препарата (снятия последней ТТС) место аппликации промывается теплой водой, высушивается ватным тампоном.
Во время всего эксперимента ведется наблюдение за общим состоянием животных, наличие тремора, птоза, судорог, прыжков, чихания, бокового положения. Результаты фиксируются каждый день относительно контрольной группы животных, особенно после отмены препарата. Оценивается синдром отмены без провокации налоксоном.
Исследования будут проводить до начала применения препарата и через 15 дней и 1 месяц применения препарата и через 4 дня после снятия последней ТТС с алпразоламом.
Животные будут помещаться в центр установки «открытого поля». В течение двухминутного пребывания крысы в открытом поле будут регистрировать число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квадрата в квадрат (горизонтальная двигательная активность), число заглядываний в отверстия (исследовательская активность).
Также будет проводиться изучение влияния препарата на координацию движений и мышечный тонус, используя тест подтягивания на горизонтальной перекладине и на установке вращающегося стержня для крыс. Исследования будут проводить до начала применения препарата и через 15 дней и 1 месяц применения препарата и через 4 дней после снятия последней ТТС с алпразоламом.
ТII-6. Изучение влияния ТТС с алпразоламом после выработки условно-рефлекторной реакции предпочтения места
После выработки условно-рефлекторной реакции предпочтения места, мышам апплицируют ТТС с алпразоламом или пластырь (контроль) каждые 48 часов в течение 1 месяца. Половину животных через 24 часа после аппликации ТТС или пластыря помещают в отсек с белым полем, половину – с черным полем. Изучение влияния препарата проводят на 6, 15 и 30 день, регистрируют время, проведенное в каждой камере. Критерием наличия у препарата подкрепляющих свойств считают достоверно большее время, проведенное в камере, ассоциированной с препаратом.
ТII-6. Изучение влияния ТТС с алпразоламом на память после выработки условно-рефлекторной реакции предпочтения места
После выработки условно-рефлекторной реакции предпочтения места (Т-образный лабиринт с пищевым подкреплением), крысам апплицируют ТТС с алпразоламом или пластырь (контроль) каждые 48 часов в течение 1 месяца. Изучение влияния препарата проводят на 6, 15, 30 и 36 день, регистрируют время, проведенное в поиске места пищевой закладки. Так же проводят изучение времени развития условно-рефлекторной реакции предпочтения места у крыс на фоне применения препарата.
ТII-4. Исследование аллергизирующих свойств ТТС с алпразоламом на кроликах
После завершения адаптационного периода, снятия фоновых показателей и массы тела у кроликов, будут сформированы следующие группы животных (разделенные на 2 подгруппы каждая, самцов и самок):
- 1 группа – контроль, 2 группа – 5-кратная предполагаемая высшая терапевтическая доза для человека (10 см2). 3 группа – 10-кратная высшая терапевтическая доза для человека (20 см2).
Лекарственная форма препарата будет апплицироваться (наноситься) животным каждые 48 часов (попеременно на разные участки кожи) в указанных дозах трехкратно. На протяжении эксперимента будет отмечаться общее состояние и поведение животных (динамика массы тела, аппетит, двигательная активность, состояние шерстного покрова).
Реакцию кожи участка аппликации ТТС будут оценивать каждый раз при снятии ТТС по универсальной шкале , : 0 - видимой реакции нет; 1 - слабая очаговая эритема; 2 - легкая очаговая эритема; 3 - умеренная сплошная или сливающаяся очаговая эритема; 4 - резкая сплошная эритема; 5 - умеренная или резкая эритема с утолщением кожной складки; 6 - резкая эритема, значительное утолщение кожи, очаговые геморрагии или изъявления.
Метод феномена анафилактического шока
Суть метода заключается в том, что у экспериментальных животных, сенсибилизированных лошадиной сывороткой, после разрешающей инъекции антигена развивается анафилактический шок, самыми характерными признаками которого являются падение артериального давления, остановка деятельности сердца. При вскрытии животных наблюдается вздутие легких. Препараты, не обладающие аллергогенным действием, анафилактического шока, а тем самым и характерных изменений артериального давления и других не вызывают.
Исследования будут проводится 6 половозрелых кроликах-самцах ( масса тела 2,0 – 2,0 кг). Подготовку животных к аппликации и аппликацию ТТС проводят как описано выше. Всего проведут 3 сенсибилизирующие аппликации образцов ТТС в дозе 3 см2 /кг. продолжительность аппликации 3 суток.
Первая сенсибилизирующая аппликация ТТС на кожу спины кролика соответствует первой сенсибилизирующей инъекции антигена при оценке аллергенных свойств лекарственных веществ по общепринятой схеме. Через 3 суток ТТС удаляют, оценивая реакцию кожи данного участка аппликации. Спустя 3 дня проводят вторую, а через 3 дня после окончания второй аппликации - последнюю (третью) сенсибилизирующую аппликацию по той же схеме. По истечении латентного периода (на 14 сутки после завершения сенсибилизирующей аппликации ТТС) проводят разрешающую аппликацию, соответствующую разрешающей инъекции: на кожу спины кролика наклеивают ТТС в дозе 9 см2/кг, равной сумме трех сенсибилизирующих доз. При этом оценивают ряд функциональных показателей. До аппликации, после третьей сенсибилизирующей аппликации, а также спустя 4 часа после разрешающей аппликации ТТС исследуют лейкоцитарную формулу крови, особое внимание обращая на процентное содержание эозинофилов. До разрешающей аппликации ТТС и спустя 4 часа после нее исследуют время свертываемости крови, измеряют ректальную температуру, регистрируют число сердечных сокращений и частоту дыхания кроликов. Кроме того, не менее чем в течение 10 минут кровавым способом при помощи ртутного манометра регистрируют артериальное давление в сонной артерии (через 4 часа после разрешающей аппликации ТТС).
Исследования вышеуказанных функциональных показателей будут проводить через 4 часа после разрешающей аппликации потому, что предполагается, что при аппликации ТТС препарат обнаруживается в крови спустя 1-4 часа и сохраняется в плазме крови.
ТII-5. Изучение анксиолитической активности ТТС с алпразоламом
Согласно Руководству анксиолитический эффект будут исследовать в условиях методики конфликтной ситуации, седативный эффект оценивать по влиянию на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность в открытом поле; для изучения миорелаксантного действия используют тест вращающегося стержня. Регистрацию эффектов после аппликации ТТС с адпразоламом будут проводить через 4, 8 часов, сутки, 2 суток и 4 суток. Для сравнения будут использовать субстанцию алпразолама. Регистрацию эффектов субстанции алпразолама будут проводить в те же интервалы времени, что и после аппликации ТТС с алпразоламом
Исследования будут проводиться на белых нелинейных крысах-самцах массой 200-230 г. Число животных в каждой группе - 10-12 особей. ТТС с алпразоламом площадью 3 см2 наносится аппликационно на выбритый участок кожи у основания хвоста через сутки после процедуры удаления шерсти у животных со здоровой кожей. Фиксирование ТТС с алпразоламом проводится пластырем с гипоаллергенным клеем. Для сравнения используют субстанцию алпразолама, которую вводят крысам внутрь в традиционной терапевтической дозе 5 мг/кг.
Изучение анксиолитического действия веществ методом конфликтной ситуации.
Для моделирования конфликтной ситуации используется методика, основанная на столкновении (конфликте) у крыс питьевой мотивации и электроболевого раздражения. Опыт проводят в течение 3 дней. В первый день животных полностью лишали питья. На следующий день, т. е. после 24-часовой депривации, проводят выработку навыка взятия воды из поилки. Для этого животных на 5 мин помещают в экспериментальные камеры размером 27,5 х 27,5 х 40 см с поилками – стеклянными сосудами с пробками из нержавеющей стали и электродным полом, соединенным со стабилизаторами тока. Животные обследуют камеру, через некоторое время находят поилку и начинают пить. В первый день взятия воды ненаказуемо и их число характеризует выраженность питьевой мотивации. Животные, не подходившие к поилке в течение 5 минут, из опыта исключаются.
На третий день тренировки крыс снова на 10 мин помещают в экспериментальные камеры, но на этот раз через 10 сек после первого взятия воды на соски поилок и электродный пол камер подают постоянный ток силой 0,5 мА. Таким образом, каждое взятие воды становится наказуемым и для удовлетворения жажды крысам надо преодолеть страх, развившийся в результате наказания. Мерой выраженности эффекта считают статистически достоверное увеличение числа наказуемых взятий воды из поилок животными (попытки пить, несмотря на получение болевых раздражении) в опытной группе по сравнению с контрольными животными.
Изучение седативного действия ТТС с алпразоламом по сравнению с субстанцией алпразолама
Регистрацию седативного эффекта ТТС с алпразолама и субстанции алпразолама проводят через 4, 8 часов, сутки, 2 суток и 4 суток после аппликации ТТС с алпразолама или введения внутрь субстанции. Седативный эффект оценивают по изменению ориентировочно - исследовательского поведения животных в условиях методики открытого поля.
Установка "открытое поле" для крыс представляет собой камеру размером 60х60 см с прозрачной крышкой. Пол камеры разделен равномерно линиями на 9 квадратов с 16 отверстиями диаметром 4 см. В течение двухминутного пребывания крысы в открытом поле регистрируют число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квадрата в квадрат (горизонтальная двигательная активность), число заглядываний в отверстия (исследовательская активность).
Изучение миорелаксантного действия ТТС с алпразоламом в сравнении с субстанцией алпразолама
Для изучения миорелаксантного действия используют методику оценки нарушений координации движений у крыс по тесту вращающегося стержня. На горизонтальный стержень диаметром 4 см, вращающийся со скоростью 3 об./ мин., помещают животное. Неспособность животных под влиянием препарата удерживать равновесие на стержне в течение 2-х минут рассматривают как проявление нарушения координации движений и миорелаксации.
План фармакокинетических исследований препарата ТТС с алпразоламом (ТIII-3)
Исследование будет проведено на 6 кроликах-самцах (шиншилла) с массой тела 2,50 ± 0,50 кг, которым будут присвоены соответствующие номера. Для расчета скорости трансдермального переноса необходимо определить общий объем распределения алпразолама и константу скорости его выведения, поэтому этим же животным внутривенно однократно будут вводить 0,5% раствор субстанции алпразолама в дозе 10 мг (2 мл). Раствор вводят (2,0 мл) в краевую ушную вену в течение 1 мин.
Площадь апплицируемой ТТС выбирается в пределах от 72 до 96 см2 для человека, что соответствует дозе 25,94 – 32,73 см2/кг на кроликах.
Внутривенное введение. При изучении фармакокинетики алпразолама у кроликов после внутривенного введения образцы крови отбирают из краевой ушной вены через 0, 3, 5, 10, 30, 45 мин и 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 24,0, 48,0 и 72,0 час после введения препарата.
Нанесение ТТС. При изучении скорости трансдермального переноса алпразолама образцы крови отбирают из краевой ушной вены через 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 24,0, 48,0 и 72,0 час после введения препарата. По истечении этого времени ТТС снимают и отбирают образцы крови еще 3 суток через каждые 24 час. После снятия ТТС участок кожи животных, соприкасавшийся с лекарственной формой, тщательно обрабатывают теплой водой с мылом.
Пробы крови отбирают с помощью шприца (3,0 мл) и переносят в стеклянные пробирки, предварительно обработанные гепарином. Животных кормят через 4 часа после введения/нанесения препарата. Образцы крови отстаивают в течение 15 минут в условиях комнатной температуры, затем центрифугируют (3000 об/мин в течение 10 минут) получая плазму крови. Плазму хранят при -20°С.
