Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 10 )

Таблица 6

Сравнительная оценка ростообеспечивающих свойств сред (М±m)

Бактерии	Количествовыросшихколоний, КОЕ
«Hugh Leifson Medium»	«Mac Conkey аgar»	«Hi Chrom Medium»	«CN agar»	Cetrimide agar»
P. aeruginosa	-	-	-	74,15±1,35	86,25±2,31
81,33±1,63	64,15±1,35	84,15±1,35	-
S. enteritidis	-	-	-	-	-
90,17±1,47	69,15±2,15	80,17±1,44
E. coli	70,0 ±1,41	72,15±1,10	75,0 ±1,41	-	-
-	-	-
K. pneumoniae	79,67±0,89	-	-	-	-
-	77,66±0,69	79,67±0,89
Y. enterocolitica	-	-	-	70,17±1,27	-
62,17±1,37	54,13±1,37	42,17±1,37	-
C. freundii	78,0 ±1,12	76,0 ±1,1	-	-	73,25±1,3
-	-	76,0 ±1,21

Примечание: числитель – «+»; знаменатель – «-»

При оценке ингибирующих свойств сред в опытах со смешанной суспензией микроорганизмов установлено, что на среде «Cetrimide agar» среднее количество колоний P. аeruginosa и  C. freundii составило: 41,2±2,1/39,2±3,7 (табл. 7).

Таблица 7

Сравнительная оценка ингибирующих свойств сред (M±m)

Среда	Количество колоний микроорганизмов КОЕ
P. аeruginosa P. fluorescens	P. аeruginosa P. putida	P. аeruginosa S. enteritidis	P. аeruginosa Е. coli	P. аeruginosa C. freundii
«Hi Chrom Medium»	41,3±2,6 39,4±1,7	39,10±2,67 41,17±2,40	33,2±3,9 37,23±1,20	45,7±2,13 47,6±3,5	40,3±3,4 35,4±2,7
«Cetrimide agar»	42,3±3,7 –	47,3±3,3 –	47,3±3,3 –	41,60±1,96 –	41,2±2,1 39,2±3,7

Условные обозначения: «–» нет роста микроорганизмов

Для оценки специфичности сред (отношение количества идентифицированных культур микроорганизмов от общего числа типичных для вида колоний) проводили опыты со смешанными суспензиями микроорганизмов P. aeruginosa, S. enteritidis, E. coli, K. pneumonia, Y. enterocolitica, C. freundii содержащими 1 млрд. бакт. клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. ). Суспензии культур микроорганизмов в объеме по 30 мл вносили в стерильные полиэтиленовые пакеты («NascoWHIRL-PAK», Germany), содержащие по одной куриной голени, выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин, периодически встряхивая. Затем голени переносили в полиэтиленовые пакеты, содержащие по 50 мл пептонной воды и  выдерживали в течение 15 мин. Для выделения чистой культуры микроорганизмов суспензию из пакетов высевали по 0,1 мл на поверхность дифференциально-диагностических сред, культивировали при 37 °С 24 ч.  При видовой идентификации типичных для семейства Pseudomonaceae изолированных колоний, исследовали морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов. При оптической микроскопии в мазках, окрашенных по Граму P. aeruginosa были представлены грамотрицательными бактериями, длиной 0,5 – 1,4 мкм и шириной 0,2 – 0,4 мкм. При наличии грамотрицательных палочек аэробные (расщепление глюкозы путем окисления с образованием кислоты без газа – окислительно-ферментативный тест Хью-Лейфсона), оксидазаположительные, каталазаположительные культуры микроорганизмов пересевали в пробирки со скошенным МПА для изучения ферментативных свойств. Культуры микроорганизмов P. aeruginosa – восстанавливали нитрат в нитрит, обладали протеолитической активностью (разжижали желатин и свернутую кровяную сыворотку, гидролизовали казеин), свертывали лакмусовое молоко и расщепляли сгусток, не ферментировали мальтозу, не образовали индол, сероводород.

При культивировании микроорганизмов на средах «Hugh Leifson Medium», «Mac Conkey аgar» и «CN agar» за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для идентификации псевдомонад относительно невысокая от 21,4 до 66,6%, не позволяло дифференцировать P. aeruginosa от сходных видов бактерий. Для дифференциации бактерий рода Pseudomonas специфичность среды «Hi Chrom Medium»  выше по сравнению с предыдущими средами  80,0 % за счет выявления специфического фермента «в-глюкозидаза» и «в-галактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidis и C. freundii не продуцировали данные ферменты,  формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica продуцировали фермент «в-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии, а E. coli продуцировали фермент «в-галактозидаза», формировали фиолетовые колонии.

Для видовой идентификации эффективной является селективная среда «Cetrimide agar» (специфичность 94,8 %) за счет наличия цетримида (этилтриметиламмоний-бромид) –  четвертичное аммониевое соединение, подавляется рост сопутствующих бактерий (табл. 8).

Таблица 8

Изучение эффективности схемы бактериологического исследования на наличие микроорганизмов рода Pseudomonas

Среды	Количество типичных колоний	Количество культур микроорганизмов
Всего	%
«Hugh Leifson Medium»	14	3	21,4
«Mac Conkey аgar»	12	4	33,3
«CN agar»	12	8	66,6
«Hi Chrom Medium»	15	12	80,0
«Cetrimide agar»	20	19	94,8

Следующей задачей исследований явилось изучение контаминации бактериями пищевых продуктов к определенному  объему (0,1 мл) разведения исследуемых  образцов  в ступке добавляли 10 мл стерильного 0,9 %-ного раствора NaCl, затем тщательно размешивали и выдерживали 10-15 мин при комнатной температуре для осаждения крупных частиц, из основного разведения делали ряд  последующих  разведений, используя три  способа: способ  I – серийные разведения в 0,9 % NaCl; способ II – серийные разведения  в 0,7 % МПА; способ  III – посев на тест-пластины «Petrifilm». Из исследуемых образцов готовили серию десятичных разведений в пробирках, содержащих 9 мл  0,9 % NaCl, затем при относительно переносимом объеме (0,1 мл)  из соответствующих последних разведений проводили посев на поверхность питательных сред в

чашки Петри – способ I. После автоклавирования (121 °С, 15 мин)  0,7 % раствор МПА  разливали в пробирки по 9,0 мл,  из исследуемых образцов готовили серию десятичных разведений, затем  из соответствующих разведений производили посев каплями по 0,1 мл пипеткой вместимостью 1 мл, в одну чашку Петри наносили до 6 капель различных десятичных разведений образцов, так чтобы  капли не сливались, каждая капля соответствовала  посеву 0,1 мл суспензии на поверхности одной чашки – способ II.  Производили посев 1 мл соответствующих последних разведений для определения КМАФАнМ  под верхнюю пленку  в центр пластин  «Petrifilm Aerobic Plate Count»,  БГКП  – «Petrifilm E. coli / Coliform Count Plate» – способ III. Количество микроорганизмов определяли через 18 ч культивирования при  37 °С по количеству колоний, выросших на питательной среде с пересчетом на количество посеянного материала и степень разведения культуры по формуле:  x = а x 10n, где x – КОЕ микроорганизмов; a – количество выросших колоний; n –  степень разведения. Определение контаминации бактериями пищевых продуктов показало, что КМАФАнМ  пищевых продуктов, определенное тремя  способами, существенно не отличалось, однако применение  в  качестве  раствора  для  разведения 0,7 % раствора МПА и тест-пластин «Petrifilm»  позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа (табл. 9).

Таблица 9

Результаты изучения количества микроорганизмов (КОЕ/ед. об)

Исследуемые пробы	Число КОЕ/ед. об	Объем среды, мл
Способы исследований
I	II	III	I	II	III
Голень куриная	32х103	36х103	31х103	120	40	-
Фарш из мяса птицы	72х103	76х103	87 х103	120	40	-
Субпродукты птицы	38х104	40х104	35х104	120	40	-
Фарш из свинины	84х105	81 х105	78х105	120	40	-
Фарш из говядины	90х105	83 х105	86 х105	120	40	-
Мясо рыбы	26х103	22х105	25х103	120	40	-
Креветки	31 х 103	28 х 103	32 х 103	120	40	-

  Примечание:  I – 0,9 % NaCl;  II – 0,7 % МПА;  III – тест-пластины «Petrifilm»