Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 14 )

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Бактерии P. aeruginosa при инфицировании восприимчивых видов реализуют факторы вирулентности, связанные с адгезией к живым тканям путем контакта с рецепторами эукариотической клетки, инвазией, обусловленной деплимеризующими биологические субстраты протеолитическими ферментами,  синтезом экзотоксинов (гемотоксин, лейкоцидин, цитотоксины) и эндотоксина липополисахаридной природы. (Van Delden, Iglewski, 1998).  При бессимптомной персистенции P. aeruginosa в организме бактерионосителей может происходить контаминация пищевого сырья, P. aeruginosa обладают свойством сохраняться в биологических материалах при низких температурах и накапливаться в пищевых продуктах при холодильной обработке, что обусловливает  социальную значимость профилактических мероприятий в начале «пищевой цепи» (в животноводстве, птицеводстве и перерабатывающей промышленности).  В этой связи для успешного функционирования объектов животноводства к числу приоритетных задач относится изыскание эффективных антибактериальных препаратов, эффективность которых определяется прежде всего  экологической безопасностью и  широким спектром действия по отношению к патогенным микроорганизмам, в том числе, P. аeruginosa обладают с множественной лекарственной устойчивостью вследствие повышенного синтеза экзополисахаридов, формирующих биопленки, замедляющей диффузию антибактериальных препаратов (, 1986; и соавт.,2012; и соавт., 2013; Anwar H. et al., 1992; Alkawash M. A. et al., 2006; Bjarnsholt T., 2009). В настоящее время установлено, что экзополисахариды,  продуцируемые в виде биопленок, обладают защитным эффектом от действия активного кислорода. Для углубления научных познаний малоисследованных вопросов этиологической значимости факторов вирулентности P. aeruginosa целесообразным является  изучение динамики патологических процессов на восприимчивых  лабораторных моделях,  апробация, изыскание и подбор  эффективных диагностических сред с селективными свойствами, тест-систем для дифференциации сходных видов бактерий, экспресс-тестов изучения чувствительности к антибактериальным препаратам, что и определило актуальность темы диссертационной работы.

Целью диссертационной работы явилось обобщение данных литературы и результатов собственных исследований по изучению дифференциально-диагностических свойств и чувствительности к антибактериальным препаратам  бактерий P. aeruginosa, выделенных из пищевого сырья и продуктов питания.

На первом этапе исследований проводили  изучение морфологических свойств бактерий P. aeruginosa, апробацию и изыскание эффективных диагностических сред с селективными свойствами. По морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам свойствам выделенные бактерии P. aeruginosa аналогичны описываемым в определителе Берджи и других источниках ( и соавт, 1995; и соавт, 2005; , , 2008).  Установлено, что на МПА 50,1 % колоний имели  округлую форму, ровные края –  S-форма; 33,4 % плоские неправильной формы, 8,4 % складчатые, непрозрачные, с шероховатыми  краями, d≥3,0 мм –  R-форма; 6,7 % слизистые – М-форма. На среде «CIN agar»  54,2 % – М-форма; 36,5 %. – карликовые. На среде «Cetrimide agar» 88,0 % колониий  – S форма. Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной  микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень мелких (≤1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией, частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы. При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать в исходное состояние, так, через 7–10 суток реверсировавшие культуры визуально формировали  нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых тонкой слизистой биопленки. При нарушении  структуры бактериальных клеток и  перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные L-формы. Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на уровне структуры бактериальных клеток  P. aeruginosa, проявляющаяся  диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы  имели типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными для данного вида  бактериями по морфологическим критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками). 

При изучении дифференциально-диагностических свойств P. aeruginosa объектом исследования служили питательные среды «Hugh Leifson Medium»;«Mac Conkey аgar»; «Hi Chrom Medium»; «CIN agar», «Cetrimide agar». При изучении ростообеспечивающих свойств среды «Hugh Leifson Medium» установлено, что среднее количество колоний P. aeruginosa составило – 81,33±1,63; S. enteritidis – 90,17±1,47; E. coli - 70,0 ±1,41; K. pneumoniae – 79,67±0,89; Y. enterocolitica – 62,17±1,37; C. freundii – 78,0±1,12. При посеве суспензии, содержащей около 100 бактериальных клеток, среднее количество колоний P. aeruginosa, выросших на среде «Mac Conkey аgar» составило 64,15±1,35; S. enteritidis – 69,15±2,15; E. coli – 72,15±1,10; K. pneumoniae – 77,66±0,69; Y. enterocolitica – 54,13±1,37;  C. freundii – 76,0 ±1,1. При оценке ростообеспечивающих, ингибирующих  и дифференциально-диагностических свойств хромогенных сред «Hi Chrom Medium», при посеве суспензии, содержащей около 100 бактериальных клеток, среднее количество колоний P. aeruginosa составило – 84,15±1,35; S. enteritidis –  80,17±1,44; E. coli - 75,0 ±1,41; K. pneumoniae –  79,67±0,89; Y. enterocolitica – 42,17±1,37;  C. freundii – 76,0 ±1,21. На среде «CIN agar» –  P. aeruginosa –  74,15±1,35; Y. enterocolitica – 70,17±1,27; S. еnteritidis, E. сoli, K. рneumoniae, C. freundii – рост отсутствовал. На среде «Cetrimide agar» P. aeruginosa –  86,25±2,31; C. freundii – 73,25±1,3; S. еnteritidis, E. сoli, K. рneumoniae, Y. enterocolitica – рост отсутствовал.  При культивировании микроорганизмов на средах «Hugh Leifson Medium», «Mac Conkey аgar», «CIN agar» за счет наличия достаточно часто встречающегося фермента (лактоза, глюкоза, маннит), специфичность сред для идентификации P. aeruginosa относительно невысокая –  от 21,4 до 66,6%, что не позволяло дифференцировать P. aeruginosa от сходных видов бактерий. Для дифференциации P. aeruginosa специфичность среды «Hi Chrom Medium» несколько выше по сравнению с предыдущими средами – 80,0 % за счет выявления специфического фермента «в-глюкозидаза» и «в-галактозидаза», P. аeruginosa, S. enteritidis и C. freundii, не продуцирующие данные ферменты,  формировали бесцветные колонии; K. pneumoniae, Y. enterocolitica продуцирующие фермент «в-глюкозидаза», формировали сини-зеленые колонии, E. coli, продуцирующие фермент «в-галактозидаза», формировали фиолетовые колонии. Среда «Cetrimide agar» за счет цетримида (этилтриметиламмоний-бромид) подавляет рост сопутствующих бактерий. Цетримид действует как четвертичное аммониевое соединение, катионный детергент, который освобождает азот и фосфор из бактериальных клеток (за исключением псевдомонад), специфичность данной среды 94,8 %. На основании сравнительной оценки  и подбора эффективных дифференциально-диагностических сред рекомендуется использовать среды «Hi Chrom Medium», «Cetrimide agar», для дифференциации P. aeruginosa эффективной является среда «Cetrimide agar», которая обладает ростообеспечивающими  свойствами, ингибирует рост грамположительной бактерий, позволяет дифференцировать P. aeruginosa от бактерий, чувствительных к  четвертичным  аммониевым  соединениям, специфичность среды – 94,8 %.

При изучении контаминации бактериями пищевых продуктов использовали  три  способа: способ  I – серийные разведения в 0,9 % NaCl; способ II – серийные разведения  в 0,7 % МПА; способ  III – посев на тест-пластины «Petrifilm». При учете контаминации бактериями пищевых продуктов в исследованных пробах фарша из мяса  птицы КМАФАнМ составило 72х103 КОЕ/г, фарша из свинины  – 84х105 КОЕ/г, фарша из говядины – 90х105 КОЕ/г, фарша из мяса рыбы – 26х103 КОЕ/г;  креветок – 31 х 103 КОЕ/г. Определение контаминации бактериями пищевых продуктов показало, что КМАФАнМ  пищевых продуктов, определенное тремя  способами, существенно не отличалось, однако применение  в  качестве  раствора  для  разведения 0,7 % раствора МПА и тест-пластин «Petrifilm»  позволило сократить расход питательных сред, стерильной бактериологической посуды и времени проведения анализа. При первичной идентификации изолятов на среде  «Hi Chrom Medium» установлено, что из пищевого сырья и продуктов выделены 43 культур микроорганизмов, из которых 27 культур отнесены к семейству Pseudomonaceae: P. aeruginosa 19 (44, 3 %); P. fluorescens 5 (11,6 %); P. putida 3 (7,0 %); 16 – семейства Enterobactericeae: C. freundii 4 (9,3%); E. aerogenes 4 (9,3 %), P. mirabilis 5 (11,6 %),  E. tarda 3 (7,0 %) . При изучении видового состава бактерий на среде «Cetrimide agar» выделено и идентифицировано 19 культур микроорганизмов P. aeruginosa (44, 2 %), из числа которых 13, 9 % культур были выделены из продукции птицеводства; 7,0 % – фарша свинины; 11,6 % – фарша говядины; 7,0 % – мяса рыбы; 4,6 % – креветок.