Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 8 )

2. 2.  Методы изучения патогенных свойств  Pseudomonas aeruginosa

Оценку патогенных и токсигенных  свойств проводили на лабораторных моделях с использованием общепринятых методов ( и соавт., 1978; и соавт. 1980; и соавт., 2004). В опытах использовали: белые беспородные мыши (n=5); рыбы «Карп» (n=5).

Патогенные свойства при идентификации изолятов псевдомонад не типируемых по О-антигену определяли заражая внутрибрюшинно белых беспородных мышей массой 14-16 г по 0,5 см3 взвесью микроорганизмов в концентрации 1 млрд/см3 бактериальных клеток.

Для изучения токсигенных свойств исследуемые штаммы культивировали в жидкой среде Хоттингера в течение 24 ч при 37°С, при 28°С. Затем культуры микроорганизмов P. aeruginosa центрифугировали при 6000 об\мин, в течение 30 мин, полученную надосадочную жидкость вводили лабораторным животным (опыт), аналогичной группе животных  вводили стерильный бульон Хоттингера (контроль). Для оценки токсигенных свойств псевдомонад применяли следующие тесты: «дилятации кишечника» на мышах-сосунках;  «плантарный тест» и метод «кожной пробы».

При изучении токсигенности псевдомонад с использованием теста «дилятации кишечника» белых беспородных мышей-сосунков 2-3-суточного возраста за сутки до заражения отсаживали от маток и 20 ч при 25 °С выдерживали на голодной диете в стеклянных банках емкостью 0,2-0,5 л, на дно которых положен слой бумаги. Заражение проводили per rectum с использованием шприца со стериль­ным  наконечником  от  дозаторной  пипетки.  Надосадочную жидкость исследуемого микроорганизма, вводили в объеме 0,2 мл медленно и равномерно, правильность введения материала и отсутствие травмы определяли при вскрытии. Группа мышей, которым вводили стерильный бульон, служила отрицательным контролем, группа мышей, зараженных надосадочной жидкостью, энтеротоксигенного штамма P. aeruginosa, – положительным контролем. Животных, погибших в течение первого часа после заражения, исклю­чали из опыта. Через 4 ч после заражения мышей-сосунков усыпляли эфиром и вскрывали. Пинцетом зажимали нижний и верхний концы тонкого кишеч­ника, отрезали его ножницами от брыжейки, желудка и слепой кишки и пе­реносили в полиэтиленовый мешочек заранее определенной массы. Взвеши­вали тонкий кишечник и оставшуюся часть тела. Коэффициентом расширения тонкого кишечника (К) за счет накопления в просвете жидкости, продуцируемой под воздействием энтеротоксина, служило отношение массы тонкого кишечника с содержимым к массе остального тела. Определяли коэффициент расширения для каждой мыши, взятой в опыт, вы­числяя затем среднюю арифметическую и коэффициент достоверности разли­чий средних величин по отношению к отрицательному контролю. За положи­тельный результат принимали показатель, превышающий 0,090.

При использовании «плантарного теста» белым мышам надосадочную жидкость, вводили 3 мышам в область плантарной поверхности лапы в дозе 0,1 мл. В качестве контроля ис­пользовали исходную среду, которую вводили параллельно в другую лапу в той же дозе. Учет результатов проводили через 24 ч, конечности ампутиро­вали по голеностопному суставу и взвешивали на торсионных весах. Величину отека определяли по разности массы лапок мышей в контроле и опыте. Штаммы, дающие отек менее 15 мг, считали нетоксигенными; 15-34 мг – слаботоксигенными; 35-64 мг – умеренно токсигенными; 65 мг и более – высокотоксигенными. Рассчитывали среднюю арифметическую разницы массы лапок мышей в контроле и опыте.

Для определения токсигенности при использовании «кожной пробы» у морских свинок  массой 200 – 250 г, за 24 ч до начала опыта на спине тщательно выстригали волосы. Затем в участки депиляции (размеры 1,0 см3) внутрикожно шприцом с тонкой иглой срезом вверх под острым углом вводили испытуемый материал в объеме 0,1 мл. Учет результатов проводили через 24 ч после инъекции. Оценка проводилась визуально с учетом показателей: отсутствие покраснения кожных покровов – 0 баллов; наличие покраснения – 1,0 – 3,0 балла. Образование покраснений и темно-красной окраски кожных покровов свидетельствовало о наличии энтеротоксина, и штамм относили к высокотоксигенному с оценкой в 3,0 балла.

2. 3. Методы  изучения  антагонистической активности  бактерий

Антагонистические свойства микроорганизмов изучали общепринятыми методами (, 1979; , 1999) и с применением мембранных фильтров (, , 1997). 

Метод перпендикулярных штрихов. Испытуемый организм высе­вается штрихом (полоской) на поверхность агаровой пластинки чаш­ки Петри. После культивирования перпендикуляр­но штриху подсеваются различные тест-организмы. Чашки поме­щаются в термостат на 20-24 ч. Если изучаемый организм оказывает антимикробное действие, ряда тест-культура микроорганизмов будет расти вдали от штриха антагониста. Нечувствительные микробы будут развиваться в непосредственной близости от штриха изучаемого организма.

Метод агаровых блочков. Изучаемый организм высевают сплош­ным «газоном» на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. После культивирования пробочным сверлом (диаметр примерно 8 мм) вырезают агаровые блочки, которые переносят на поверхность дру­гой агаровой среды, предварительно засеянной тест-организмом. На одной чашке Петри размещают 5-7 агаровых блочков. Чашки с агаровыми блоч­ками помещают в термостат на 20-24 я. Если выде­ляемый организмом антибио­тик подавляет развитие тест - культура микроорганизмов, то вокруг агарового блочка образуется зона от­сутствия роста.

Метод высева антагониста на одной половине агаровой плас­тинки с последующим подсевом тест - культура микроорганизмов штрихами на дру­гой половине агаровой пластинки. Чашка Петри разделяется стек­лянной перегородкой пополам. В одну половину заливается пита­тельный агар, другая половина чашки остается свободной. На половину агаровой пластинки высевают сплошным «газо­ном» изучаемый микроорганизм, чашки помещают в термо­стат. После этого на оставшуюся свободную часть пластинки в чашке заливают рас­плавленный питательный агар, тест-микробы высевают штрихами, перпендикулярными границе развития антагониста.

Метод агарового блочка, находящего­ся в центре чашки Петри. В чашку Петри заливается питательный агар. В застывшем агаре стерильным  пробочным  сверлом  (диаметр 20-22 мм) вырезают агаровые блочки, которые затем переносят в другие стерильные чашки Петри. В центр каждой чашки поме­щают по одному такому бло­ку, затем в эти же чашки на свободную их часть наливают питательный агар с тем расчетом, чтобы уровень это­го агара был на 1-1,5 мм ниже уровня блочка. После того как чашки подготовлены, изучаемый микроор­ганизм высевают микробио­логической петлей на по­верхность агарового блочка, чашки помещают в термостат. Затем по радиусам агаровой пластинки высевают штрихами тест-организмы, и чашки вновь на 20-24 ч помещают в термостат. Отсутствие роста штриха тест-микроба на том или ином рас­стоянии от блочка будет указывать на угнетение его антибиотиче­ским веществом изучаемого организма.

Метод мембранных фильтров. При исследовании межвидового антагонизма, наряду с общепринятыми методами исследования, были апробированы методы с использованием мембранных фильтров (, , 1997). При апробации метода перпендикулярных штрихов на поверхность агаровой пластинки чашки Петри помещали 3-4 мембранных фильтра «Владипор» №2. Суспензию испытуемого тест-штамма микроорганизма высевали штрихом (полоской) на поверхность мембранных фильтров. После культивирования в течение 18-20 ч при  37 єС перпендикулярно штриху подсевали различные тест-культуры.

2. 4. Методы  изучения чувствительности бактерий

к антибактериальным препаратам 

Чувствительность микроорганизмов к желчи  и экстрактам растения изучали методом диффузии в агар (, , 1982). Для приготовления суспензии использовали суточную культуру микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выросших на плотных питательных средах. Суспензию наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1-2 мл, равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. В плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки). В лунки  заливали медицинскую консервированнню желчь (-Мед», Санкт-Петербург) и экстракт растения (Японская жимолость, коптис китайский, шлемник байкальский). в различных концентрациях. Чашки Петри культивировали в  термостате при 37 °С в течение 24 ч. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур вокруг лунок.

При изучении чувствительности к антибиотикам для приготовления суспензии использовали 18-ти часовые культуры микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, выросших на плотных питательных средах. Суспензию наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1-2 мл, равномерно распределяли по поверхности стерильным шпателем, после чего удаляли избыток суспензии пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Аппликацию дисков проводили с помощью стерильного пинцета. Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещали в термостат кверху дном и культивировали при  37  °С в течение 24 ч. Диаметр зон задержки роста измеряли с точностью до 1,0 мм. При измерении зон задержки роста ориентировались на зону полного подавления видимого роста. Метод позволяет определять чувствительность исследуемой культуры микроорганизмов  к нескольким антибиотикам одновременно. К недостаткам можно отнести  невозможность применения метода в случае, если антибиотики слабо диффундируют в агар (аминогликозиды).  При определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам  с помощью «Е-теста» использовали  полоску, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной. В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской «Е-тест» получали значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).  При изучении чувствительности к антибиотикам с применением  экспресс-теста «HexaDisc», представляют собой набор из 6 одиночных дисков, радиально прикрепленных к центру ("ромашка"). Комбинации антибактериальных препаратов в гексадисках составлены с учетом Методических указаний («Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» МУК 4.2.1890-04).