Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 11 )

Для идентификации изолятов, выделенных при изучении контаминации бактериями пищевых продуктов, исследуемые пробы (мясо птицы, фарш из мяса птицы, субпродукты, фарш свинины, фарш говядины, мясо рыбы, креветок) m=25,0 г, помещали в среду обогащения (Триптон – соевый бульон или сердечно-мозговой бульон) в соотношении 1:9 (масса/объем) и культивировали при 37є С 18 – 24 ч. Из среды обогащения делали высев на дифференциально-диагностические питательные среды: «Hi Chrom Medium» «Cetrimide agar» и культивировали при 37є С 18 – 48 ч. При первичной идентификации установлено, что из пищевого сырья и продуктов выделены 43 культур микроорганизмов, из которых 27 культур были отнесены к семейству Pseudomonaceae, 16 – семейству Enterobactericeae (табл. 10).

Таблица 10

Результаты изучения видового состава бактерий, выделенных

из пищевого сырья и продуктов

Исследуемые пробы	Количественный и видовой состав бактерий
КМАФАнМ	Pseudomonas	Enterobactericeae
Абс.	%	Абс.	%
Голень куриная	31±0,11 х103	1	2,3	-	-
Фарш из мяса птицы	82±0,06 х103	3	7,0	2	4,7
Субпродукты птицы	36±0,09 х104	2	4,7	4	9,3
Фарш из свинины	84±0,21х105	5	11,6	5	11,6
Фарш из говядины	90±0,15х105	5	11,6	4	9,3
Рыба	23±0,22х103	7	16,3	1	2,3
Креветки	31±0,12х103	4	9,3	-	-
Всего	-	27	62,8	16	37,2

На основе сравнительной оценке и подборе эффективной дифференциально-диагностических сред при индикации и идентификации бактерий, выделенных из пищевого сырья и продуктов, при первичной идентификации установлена эффективность среды «Hi Chrom Medium» (специфичность – 80,0 %), для количественного  учета и видовой идентификации бактерий P. aeruginosa установлена эффективность селективной среды «Сetrimide agar», специфичность идентификации – 94,8 %.  При изучении видового состава бактерий, из 43 культур микроорганизмов, выделенных из пищевого сырья и продуктов к виду P. aeruginosa относились  19 (44, 3 %) культур микроорганизмов; P. fluorescens 5 (11,6 %); P. putida 3 (7,0 %); C. freundii 4 (9,3%); E. aerogenes 4 (9,3 %), P. mirabilis 5 (11,6 %),  E. tarda 3 (7,0 %).

3. 3. Результаты изучения патогенных свойств

бактерий  Pseudomonas aeruginosa

Для оценки патогенных свойств бактерии Pseudomonas aeruginosa культивировали в жидкой среде Хоттингера при 37°С в течение 24 ч, затем центрифугировали при 6000 об\мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость использовали для определения наличия токсинов – опыт (контроль – жидкая среда Хоттингера) в тестах: «кожнореактивный фактор», «эдематозный тест», «эмбрионы птиц», «проницаемость сосудов». При оценке наличия токсина в тесте «кожнореактивный фактор» исследуемый материал в объеме 0,1 мл вводили  внутрикожно в участки депиляции кожи беспородным белым крысам, через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова (положительный результат – показатель коэффициента толщины кожи (мм), К≥1,6). Установлено, что показатели коэффициента средних величин толщины кожи колебались в пределах от 1,5±1,8 до 1,9±1,1. 

Для изучения наличия токсинов на лабораторной модели «эдематозный тест» 0,1 мл  надосадочной жидкости вводили  в плантарную поверхность лапок белых беспородных мышей, учет результатов проводили через 24 ч, сравнивая массу лапок  зараженных и контрольных животных.

При оценке  наличия токсинов с применением модели «эмбрионы птиц» 0,2 мл исследуемой жидкости вводили в аллантоисную  оболочку 14-суточных эмбрионов уток «Пекинская» и помещали в термостат при 37 °С. При учете жизнеспособности эмбрионов в овоскопе установили, что через 24 ч после заражения летальность эмбрионов составила 100,0 %. Динамика  развития  патологических  процессов  сопровождалась развитием признаков септицемии, при наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в тканях и органах дыхательной, сердечно-сосудистой системы,  наблюдали обширные кровоизлияния в зародышевых оболочках, наличие гиперемии, гемоциркуляторных изменений в тканях и органах сердечно-сосудистой и дыхательной системы, развитие перикардита, серозно-фибринозного аэросаккулита, перигепатита, катарально-фибринозного энтероколита, гиперплазии  селезенки.

При витальном исследовании продукции токсинов с применением  лабораторной модели «проницаемость сосудов» исследуемую жидкость вводили интраназально 5-суточным цыплятам породы «Белый леггорн», через 24 ч внутривенно вводили раствор красителя «синего Эванса», не проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов, результаты оценивали, сравнивая разность массы легких опытных и контрольных животных – тест «проницаемость сосудов». При наличии  токсинов бактерий коэффициент проницаемости кровеносных сосудов (К) колебался  в пределах  от 0,051±0,15 до 1,024±0,14 (табл. 7).

Таблица 7

Результаты изучения токсигенных P. aeruginosa

Лабораторная модель	P. aeruginosa	Контроль
«Кожнореактивный фактор» (мм)	1,9±1,1	1,5±1,8
«Эдематозный тест» (мг)	250,0	175,0
«Эмбрионы птиц» (баллы)	1,5-2,0	0,0
«Проницаемость сосудов» (К)	1,024±0,14	0,051±0,15

На начальном этапе экспериментальных исследований (24-32 ч после введения токсина) отмечали признаки скопления значительного количества серозно-геморрагического экссудата в просвете желудочно-кишечного тракта, сочетание общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями собственного слоя слизистой оболочки, лимфоидной инфильтрацией ворсинок тонкого отдела кишечника, скоплением плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной системы, лейкоцитарной  инфильтрацией и пролиферацией фибробластов перибронхиальной и периваскулярной  рыхлой волокнистой соединительной ткани. Через 48–96 ч после воздействия токсинов динамика патологических процессов характеризовалась кровоподтеками кожных покровов,  фибринозным перикардитом, фибринозным аэросаккулитом, катарально-фибринозным энтеритом, перигепатитом, кровоизлияниями в почках, гиперплазией селезенки, множественной  бактериальной  эмболией  кровеносных сосудов тканей и органов  сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, выделительной, иммунной систем, в паренхиматозных органах выявлялись многочисленные некротические очажки, инфильтрированные лейкоцитами, наблюдали нарушение сосудистой проницаемости сердца, легких, печени, почек, застойную гиперемию селезенки.

В органах пищеварительной системы выявляли наличие волокон фибрина, точечные, пятнистые и полосчатые кровоизлияния в слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника. В тонком отделе кишечника  бокаловидные клетки были переполнены светло-розовым секретом, наблюдали слизистую дистрофию, некроз и отторжение каемчатых эпителиоцитов. На всем протяжении кишечника наблюдалась гиперемия слизистой оболочки, инфильтрация рыхлой волокнистой соединительной ткани лимфоцитами, гистиоцитами и псевдоэозинофилами. Печень имела тусклый  цвет, пульпа органа на разрезе дряблой консистенции, выявляли дискомплексацию балочной структуры долек,  кровенаполнение  центральной вены и синусоидных капилляров, гепатоциты были увеличенными с признаками белковой и жировой дистрофии. В почках выявляли признаки застойного геморрагического инфаркта, в паренхиме органа выявлены  микроабсцессы, гиперемия сосудов с лейкоцитарной инфильтрацией некротических участков, некроз эпителия канальцев нефронов почек.

Цитопатическое действие бактерий Pseudomonas aeruginosa  на ткани и органы птиц характеризовалось преобладанием процессов, развивающихся по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, сочетанием общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями паренхиматозных органов, признаками макрофагальных реакций с последующим заполнением мозгового вещества лимфоидных фолликулов псевдоэозинофильными лейкоцитами, экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной системы. В тимусе отмечали признаки расстройства кровообращения, атрофические  процессы,  акцидентальную трансформацию, характеризующуюся уменьшением долек, исчезновением коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговое вещество и формированием кист.

3. 4. Результаты изучения антагонистических свойств  бактерий Pseudomonas aeruginosa

Для изучения антагонистических свойств псевдомонад применяли методы перпендикулярных штрихов, агаровых блочков, мембранных фильтров, лунок, тестирования в жидкой питательной среде и агаровой пленки. При использовании метода перпендикулярных штрихов на поверхность агаровой среды в чашке Петри высевали штрихом культуру исследуемого штамма и культивировали при оптимальной температуре для образования и диффузии в агар ингибиторных соединений. Затем перпендикулярно от края чашки к штриху выросшей культуры подсевали штрихом культуру тест-штамма, слегка касаясь штриха исследуемого штамма и культивировали при условиях, благоприятных для роста тест-культуры. При оценке  антагонистической активности у испытуемой культуры учитывали  величину зоны задержки роста тест-штамма. Преимущество метода заключается в учете БАВ штаммов, продуцирующих соединения небольшой молекулярной массы, которые быстрее диффундируют в толще агарового слоя и, следовательно,  дают более обширные зоны задержки роста тест-культуры. Вместе с тем недостатком методики является применение одной среды для продуцента антибиотического вещества, и тест-организм, хотя не всегда одна и та же среда одинаково благоприятна как для продуцента и образования антибиотика, так и для роста тест-организма. При исследовании антагонистической активности микроорганизмов методом агаровых блочков испытуемую культуру высевали глубинным способом впитательный агар в чашке Петри и культивировали в оптимальных условиях для образования и накопления в агаре ингибиторных соединений. Затем стерильным пробочным сверлом вырезали агаровый диск (блочок) с выросшей культурой и устанавливали его в другой чашке Петри на поверхности агаровой среды, только что засеянной культурой тест-штамма. При изучении антагонистической активности микроорганизмов методом лунок в слое агара, содержащего тест-штамм, пробочным сверлом вырезали лунку диаметром 5 –7 мм и помещали определенное количество (0,2 см3) жидкой среды с выросшей культурой исследуемого штамма бактерий. Чашку выдерживали в холодильнике для диффузии ингибиторных веществ из лунки в толщу агара, далее – в термостате для роста тест-штамма, после чего измеряли зону ингибирования тест-штамма вокруг лунки. Методом лунок можно определять антагонистическую активность чистых и смешанных культур микроорганизмов. К недостаткам метода можно отнести опасность подтекания жидкости с культурой из лунки в щель между агаром и дном чашки, что ведет к недостоверному  результату. Избежать подтекания можно путем формирования лунки, не доходящей до дна чашки, используя при заливке чашки агаровой средой соответствующие шаблон. При использовании методики мембранных фильтров культуру изучаемого микроорганизма в количестве 0,5 мкл и концентрации 107-108 кл/мл наносили в виде капли в центр мембранного фильтра, помещенного на поверхность плотной питательной среды, и культивировали при оптимальных для данного микроорганизма условиях. Затем мембранные фильтры удаляли с поверхности плотной питательной среды и на то же место помещали новые мембранные фильтры, на поверхность которых наносили взвесь исследуемых тест-штаммов патогенных бактерий в той же концентрации. Контролем служил рост культур, не подвергшихся воздействию БАВ. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявлялся рост культуры бактерий в виде пятен различной плотности и величины. При использовании методики тестирования в жидких питательных средах тест-культуру культивировали в оптимальной жидкой питательной среде, к которой добавлена бесклеточная культуральная жидкость исследуемого штамма-антагониста. При оценке антагонистической активности учитывали угнетение роста тест-штамма в сравнении с контролем (параллельная культура тест-штамма без добавления бесклеточной культуральной жидкости исследуемой культуры), определяя КОЕ микроорганизмов, метаболитическую активность – по характерному для тест-штамма признаку. При апробации методики «агаровой пленки» или «микрокультуры» на поверхность двух предметных стекол наносили стерильной нагретой пипеткой 0,2-0,3 мл горячей питательной среды (MRS-агар и МПА) и распределяли по всей поверхности стекла. При исследовании межвидового антагонизма, продуцируемые бактериями P. aeruginosa, угнетали рост бактерий S. enteritidis; K. pneumonia; C. freundii; Y. enterocolitica от 10,0±0,2 до 11,3±0,1  (табл.11).