Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 3 )

Флуоресцирующие бактерии. Эта группа объединяет представителей 12 видов бактерий. Все они синтезируют водорастворимые флуоресцирующие пигменты от желто-зеленого, до оранжевого оттенка. Некоторые из них образуют синий пигмент, нерастворимый в воде. Бактерии этой группы активно разлагают углеводы. При росте на средах с гексозами образуют кислоты; на средах с лактозой и крахмалом не развиваются. Потребляют органические кислоты, растут на средах с ароматическими соединениями; аэробы. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Распространены в воде, почве, сточных водах ( и соавт., 1990; , 1973; и соавт., 1987).

Ахромогенные бактерии. В эту группу входят бактерии, которые не синтезируют пигментов. Используют сахара, органические кислоты. Восстанавливают нитраты до нитритов. Сероводород и индол не образуют. Выделены из пищевых продуктов (пива, мяса) ( и соавт., 1990; , 1982).

Хромогенные бактерии. Эта группа объединяет бактерии 6 видов, выделенных из почвы. Фитопатогенных форм среди них нет. Все бактерии образуют желтый пигмент, нерастворимый в воде; аэробы, восстанавливают и потребляют нитраты, гидролизуют крахмал, образуют сероводород и индол ( и соавт., 1990).

Результаты, полученные при сравнении способности использовать различные углеродные соединения, подтверждают правильность разделения бактерий рода Pseudomonas на три группы по признакам пигментации. Все штаммы, отнесенные к флуоресцирующей группе, имеют общие свойства: подкисляют среду при использовании глюкозы, потребляют глюконат, разлагают ароматические соединения, обладают высокой активностью фермента цитохромоксидазы. Всех этих свойств у бактерий, отнесенных к ахромогенной и хромогенной группам, обнаружено не было. Следовательно, существует явная корреляция между характером углеводного обмена бактерий рода Pseudomonas и их пигментацией ( и соавт., 1990; , 1987; , 2004).

Существует так же таксономическое разделение на группы бактерий рода Pseudomonas на основе их физиолого-биохимических свойств. Изучено 267 штаммов, принадлежащих к 10 видам. Значительная часть таксономических данных была получена путем применения метода, предложенного Дюреном де Йонгом (1926), который заключался в детальном изучении пищевых потребностей у большого количества бактерий. У каждого штамма изучали способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 146 органических соединений. Были изучены углеводы, жирные кислоты, органические кислоты, спирты, ароматические соединения, не содержащие азота в кольце, а также углеводороды ( и соавт., 1990).

Полученные данные позволили разделить бактерии рода Pseudomonas на три группы: флуоресцирующую, кислотоиспользующую и щелочеобразующую.

В группу флуоресцирующих бактерий включены бактерии, относящиеся в основном к трем видам (Ps. aeruginosa, Ps. fluorescens, Ps. putida), и несколько представителей других видов. Все они синтезируют водорастворимый желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, используют нитраты или соли аммония как источники азота, не образуют поли-в-масляную кислоту в качестве резервного материала в клетках (, 1999; Борисова O. K., 1983).

Эта группа бактерий делится на семь различных биотипов в зависимости от некоторых специфических признаков: способности синтезировать пигменты феназинового типа, образовывать леван из сахарозы, а также по наличию сильных денитрифицирующих свойств.

Кислотоиспользующие бактерии не синтезируют пигментов; они аэробы, лофотрихи. Все образуют в клетках поли-в-оксимасляную кислоту в качестве резервного материала. Кроме этих признаков, описаны некоторые другие свойства, характерные для определенных штаммов, а не для групп бактерий (, 1974; и соавт., 1975; , 1999; , 2010).

2. Факторы вирулентности  Pseudomonas aeruginosa

Патогенность – потенциальная способность микроорганизмов вызывать инфекционный процесс,  для характеристики степени патогенности определенного штамма микроорганизмов предложен термин вирулентность(, 1972). Вирулентность (лат. virulentus – ядовитый) характеризует индивидуальное качество патогенных штаммов микроорганизмов, способность реализовать свойства патогенности при определенных условиях заражения животных.  Свойства и факторы микроорганизмов, связанные с патогенным действием, довольно разнообразны. Выделяют три наиболее важные группы факторов патогенности (вирулентности):  адгезивность – продукция антигенов адгезии, с помощью которых бактерии прикрепляются к эпителиальным клеткам макроорганизма; инвазивность – способность микроорганизмов преодолевать защитные приспособления организма и размножаться in vivo; токсигенность – способность микроорганизмов продуцировать вещества, нарушающие постоянство внутренней среды организма, путем изменения метаболических функций (, 1967; , 1980; , 1985).  Особенностью псевдомонад  является наличие широкого спектра факторов вирулентности (Bodey G. RP. et al., 1983; Rocha C. L.  et al., 2003; Scharmann W. 1976). Адгезия P. aeruginosa к абиотическим поверхностям обусловлена неспецифическими взаимодействиями (например,  за счет разницы заряда), адгезия к живым тканям осуществляется путем контакта с рецепторами эукариотической клетки (,1985; , 1988;  DholakiaP. M., 1985). Сравнительное электронно-микроскопическое исследование штаммов P. aeruginosa показало, что клетки вирулентных штаммов имеют слизеподобную капсулу, в которой различимы два слоя – внутренний ригидный, тесно связанный с клеточной стенкой, и наружный, более тонкий, гомогенный. На поверхности наружного слоя были обнаружены множественные мелкие шаровидные образования (, 1983). Данные образования определяют адгезивные свойства, обеспечивающие прикрепление бактерий к различным субстратам. Клетки авирулентных штаммов слизеподобной капсулой не обладают и имеют типичную для большинства грамотрицательных бактерий структуру. В присутствии очищенного полисахарида слизи адгезивные свойства мукоидных штаммов P. aeruginosa повышаются на 30-50 %  (Ramphai R., 1985). Экстрацеллюлярная слизь  псевдомонад представляет собой макромолекулярный комплекс, покрывающий поверхность клетки, легко выделяющийся во внешнюю среду. Слизистое вещество P. aeruginosa было выделено путем осаждения этанолом с последующей гель-фильтрацией и ионообменной хроматографией на целлюлозе,  содержало преимущественно углеводный компонент и небольшое количество белка (Adam M., 1971). В составе полисахарида обнаружены рамноза, глюкоза, манноза, глюкозамин, галактозамин, глюкуроновая кислота. В значительном количестве в полисахариде обнаружены N - и О-ацетильные группировки (Atic M., 1968). Химический состав слизи вирулентных и авирулентных штаммов P. aeruginosa различен (Hingst V., 1987; Morihapa K., 1963, 1965). Продукция слизи является одним из характерных видовых признаков псевдомонад ( и соавт., 1981). Слизь придает характерную вязкость бульонным культурам и колониям мукоидных штаммов. Электронно-микроскопическое исследование показало, что слизь гелеобразной консистенций, окружающая неравномерным слоем бактериальную клетку мукоидных штаммов псевдомонад, благодаря непрочным связям с клеточной стенкой диффундирует в окружающую среду. При  культивировании псевдомонад наличие в питательной среде серосодержащих соединений влияет на продукцию слизи, ответственным компонентом слизи за токсигенные и антигенные свойства является гликолипопротеид (ГЛП) (Bartell P. F.,1968; Bartell P. F. et al., 1968).  Экстрацеллюлярная слизь псевдомонад наряду с капсулами и капсулоподобными образованиями относится к группе факторов патогенности, выполняющих функцию защиты клеток от фагоцитоза (,1985). Штаммы  псевдомонад продуцируют фимбрии или пили – выросты нитевидной формы, расположенные на полюсах бактериальной клетки в количестве 2–12 на каждом полюсе диаметром 5,2 нм, длиной 2,5 мкм, состоящие  из белковых субъединиц с молекулярной массой 15000–18000, содержащие свыше 50% гидрофобных аминокислот. У псевдомонад обнаружено  два типа пилей: полярные, тонкие выросты и неполярные более толстые пили, с которыми связывают передачу плазмид лекарственной резистентности. С помощью электронной микроскопии устоновлено, что пили расположены перитрихиально на наружной мембране стенки в количестве от 1 до 60 на клетку, значительно меньше, чем у Е. coli. Длина пилей 6 нм.  Связи между пилеобразованием и вирулентностью штаммов, а также связи между наличием пилей и О-серогруппами или иммунотипами не установлено. аeruginosa  определяется в основном внеклеточной слизью, экзотоксином А и другими экзопродуктами метаболизма (, 1991; , 1999; Борисова O. K. и соавт., 1983; , 1987; , 2011).

Инвазивные свойства P. aeruginosa обусловлены протеолитическими ферментами, которые  относятся к группе факторов патогенности, способных деполиметризовать субстрат, препятствующий проникновению и распространению возбудителя (, 1977,1985). Для локального продвижения возбудитель деградирует ткани макроорганизма с помощью  ферментов (протеазы и фосфолипазы), а также системы секреции III, которая может доставлять синтезированные токсины и ферменты непосредственно в эукариотическую клетку  (Эль-Базза, 1987; ,1975; Pace J. L. et al., 2005; , 1975;  Pasmans F. et al., 2012) . Протеолитические ферменты  псевдомонад связаны с патогенностью самого возбудителя и действуют как агрессины, подавляя функцию иммунной системы и увеличивая инвазию бактерий. На этапе локальной инвазии  происходит размножение возбудителя и достижение количества, достаточного для системной инфекции, характерным механизмом для этой стадии является образование биопленки. Отмечено, что снижается вирулентность микроорганизмов, включается большая группа механизмов, направленных на защиту от иммунной системы и стрессовых факторов, происходит распространение бактерий по всему организму, биопленка диспергируется и разносится с кровотоком (табл. 4).

Таблица 4

Факторы  вирулентности  P. aeruginosa

при развитии инфекционного процесса  ( и соавт., 2013)

Факторы вирулентности	Механизм дейстия
Клинические проявления
1. Инвазия
Пили	Адгезия, хемотаксис, основа для биопленки
Воспаление
Щелочная протеаза	Деградация фибрина, эластина, коллагена
Некрозы, геморрагии
Фосфолипаза С	Расщепление лецитина
Деструкция легочного сурфактанта, колонизация легких
Секреция III	Секретиреция бактериальных токсинов
Некрозы, деградация тканей
Альгинат	Служит основой для биопленки
Токсическое действие на нейтрофилы
Сидерофоры	Регуляция синтеза факторов вирулентности
Хелатирование железа
Пиоцианин	Ингибирование факторов роста других бактерий
Размножение и колонизация
Биопленка	Концентрация и размножение клеток в полисахаридном матриксе
Персистенция, устойчивость к антибактериальным препаратам
Хронические инфекции
Системы кворум-сенсинга	Кооперация, регуляция факторов вирулентности
Передача информации с помощью специальных химических медиаторов

Токсины и токсические продукты Pseudomonas aeruginosa дифференцируются на экзо - и эндотоксины. Экзотоксины представлены продуктами жизнедеятельности с широким спектром активности: экзотоксин А – нарушает организацию матрицы белкового синтеза; экзотоксин S – вызывает глубокие патологические процессы в легких; цитотоксин – повышает проницаемость клеточных мембран, что приводит к структурному изменению клеток, также градиентов K+, Na+, Ca+ и глюкозы; гемолизины – приводят к развитию некротических поражений (особенно в печени и легких). Патогенетическое значение эндотоксина заключается в развитии лихорадки, олигурии, лейкопении. Другой продукт жизнедеятельности – нейраминидаза – нарушает процессы метаболизма веществ, содержащих нейраминовые кислоты, например, в соединительнотканных элементах. Экзотоксин А - экстрацеллюлярный белковый продукт, который продуцируют 90 % клинических штаммов псевдомонад. Молекулярная масса белка составляет 66000-71500, изоэлектрическая точка – 5,1. Характерной особенностью экзотоксина А является высокое содержание кислых аминокислот и большое соотношение аминокислот аргинин/лизин.  Экзотоксин А P. aeruginosa обусловливает летальность многих экспериментальных животных (Liu P. V., 1966, ,1981; , 1982; Baechler C. A., 1974; и соавт., 1984; Appleton A. K.,1986; Bergan T., 1981;  Bartell P. F. et al., 1968; Sensacovic J. W. et al., 1974). Экзотоксин А, являясь ферментом с аденозин-дифосфатрибозил – трансферазной активностью, подобно дифтерийному токсину, обладает способностью переносить остаток аденозин-дифосфат-рибозы с «NAD» на фактор элонгации-2, тем самым лишая возможности последнего удлинить полипептидную цепь вновь синтезируемых белковых молекул на рибосомах (Iglewski B. N., 1975). Антитоксическая сыворотка к очищенному препарату экзотоксина А предохранет от гибели мышей при заражении летальной дозой гомологичного штамма P. aeruginosa (Liu P. V., 1961, 1966; Liu P. V. et al., 1966; Liu P. V. et al., 1961). Экзотоксин А обладает выраженным цитотоксическим действием, которое проявляется через час после инокуляции в клеточную культуру животного или человеческого происхождения. Экзотоксин А оказывает влияние на клетки иммунной системы, в частности, токсичен для макрофагов (Pollack M. L.,1978; Pollack M. L. et al., 1978). Парентеральное введение очищенного препарата экзотоксина А вызывало гибель мышей, собак, обезьян в течение первых двух суток. При патологоморфологическом изучении печени этих животных через 4 часа после введения экзотоксина А уже были отмечены дегенеративные изменения и частичный некроз клеток. Полный некроз клеток наблюдали через 48 часов после введения экзотоксина А. При  исследовании сывороток крови экспериментальных животных обнаружено увеличение уровня аминотрансфераз и щелочной фосфатазы. Экзотоксин А обнаруживается в крови через 3 часа после парентерального введения; более высокие концентрации экзотоксина А обнаруживались в почках, более низкие – в печени, селезенке, поджелудочной железе, сердце, легких, мозге и даже в передней камере глаза. Через 3 часа после введения экзотоксина А подавлялся синтез белка в печени на 50 %, а к моменту гибели на 100 % в печени и на 50 % в остальных органах. Эти данные служат прямым подтверждением того, что в основе патологического процесса лежат глубокие нарушения клеточного метаболизма (Pavlovskis O. R., 1974; Pavlovskis O. R. et al., 1976). Снижение синтеза белка в органах животных при введении им очищенного экзотоксина А отмечали и другие исследователи, уровень синтеза белка в органах при инокуляции очищенных препаратов экзотоксина А и культуры псевдомонад почти не различался, что доказывает существенную роль экзотоксина А в патогенезе псевдомоноза (Streritz D. D., 1978). Для максимального проявления патогенных свойств клетки псевдомонады, используемые для заражения животных, должны активно продуцировать экзотоксин А (Woods D. E.,1983; Woods D. E. et al., 1983). Возможность выявления экзотоксина А (ЭТА) показана при скрининге клинических штаммов P. aeruginosa с помощью иммуно-ферментного метода с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных фильтров. С помощью этого метода была определена способность образовывать ЭТА у 88,5% клинических штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных и из объектов внешней среды (,1990; и соавт., 1990). Экзотоксин А псевдомонад относится к  группе факторов патогенности с токсической функцией, ответственных за формирование специфического патологического синдрома (, 1977; , 1985). Экзотоксин S обнаруживается только у высоко  вирулентных штаммов P. aeruginosa. Механизм повреждающего действия на клетки пока неясен, однако известно, что инфекции, обусловленные экзоэнзим-3-продуцирующими штаммами P. aeruginosa, нередко заканчиваются летально.  P. aeruginosa продуцирует гемолизины двух типов: термолабильную фосфолипазу С и термостабильный гликолипид. Фосфолипаза С разрушает фосфолипиды в составе сурфактантов на альвеолярной поверхности легких, вызывая развитие ателектазов (бронхоэктазов) при патологии респираторного тракта. Протеолитические ферменты псевдомонад, расщепляет белковые молекулы на низкомолекулярные компоненты, обеспечивают рост и размножение бактерий (Carrol S. F., 1987; Carrol S. F. et al., 1987). Практически все штаммы P. aeruginosa  в той или иной степени обладают протеолитической активностью (Rhame F. S., 1980; Scharmann W., 1976). Протеолитические ферменты играют наряду с экзотоксином А значительную роль в патогенезе псевдомоноза ( и соавт., 1986; Holloway D. W., 1975; Homma J. Y., 1976; Dholakia P. M., 1985; Johes L. F., 1974; Woods D. E.,1983). Наиболее важная роль в патогенности P. aeruginosa принадлежит экзотоксину A, который считается важнейшим токсином для этого биологического вида. Механизм функционирования подобен механизму функционирования дифтерийного токсина и основан на блокаде синтеза белка ( и соавт., 1990; Dholakia P. M. et al., 1985; Holloway D. W. et al., 1975; Homma J. Y., 1976; Hoyle BD et al., 1990).