Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 15 )

Следующим этапом исследований явилось изучение факторов вирулентности P. aeruginosa. Особенностью P. aeruginosa  является наличие широкого спектра факторов вирулентности (Bodey G. RP. et al., 1983; Rocha C. L.  et al., 2003; Scharmann W. 1976). Адгезия P. aeruginosa к абиотическим поверхностям обусловлена неспецифическими взаимодействиями (например,  за счет разницы заряда), адгезия к живым тканям осуществляется путем контакта с рецепторами эукариотической клетки (,1985; , 1988;  DholakiaP. M., 1985).  Токсины и токсические продукты P. aeruginosa дифференцируются на экзо - и эндотоксины. Экзотоксины представлены продуктами жизнедеятельности с широким спектром активности: экзотоксин А – нарушает организацию матрицы белкового синтеза; экзотоксин S – вызывает патологические процессы в легких; цитотоксин – повышает проницаемость клеточных мембран, что приводит к структурному изменению клеток, гемолизины – приводят к развитию некротических поражений печени и легких  (, 1985;  , 2001; , 2004; , , 2007; , 2011; Smith H. R., Scotland S. M., Willshaw G. A. et al., 1988; Моrаn А. Р.,  1995; Sears C. X., Kaper J. B., 1996; Fekete P. Z., Gerardin J., Jacquemin E., 2002). Изучение токсигенных свойств P. aeruginosa проводили с использованием лабораторных моделей «кожнореактивный фактор», «эмбрионы птиц», «проницаемость сосудов». При оценке наличия токсина в тесте «кожнореактивный фактор» исследуемый материал в объеме 0,1 мл вводили внутрикожно в участки депиляции кожи беспородным белым крысам, через 24 ч учитывали результаты изменений кожного покрова (положительный результат – показатель коэффициента толщины кожи (мм), К≥1,6). Установлено, что показатели коэффициента средних величин толщины кожи колебались в пределах от 1,7±1,8 до 1,9±1,12.  При оценке  наличия токсинов с применением модели «эмбрионы птиц» 0,2 мл надосадочной жидкости вводили в аллантоисную  оболочку 14-суточных эмбрионов уток «Пекинская» и помещали в термостат при 37 °С. При учете жизнеспособности эмбрионов в овоскопе установили, что через 24 ч после заражения летальность эмбрионов составила 100,0 %. Динамика  развития  патологических  процессов  сопровождалась развитием признаков септицемии, при наличии бактериальной эмболии и нарушения кровообращения в тканях и органах дыхательной, сердечно-сосудистой системы наблюдали обширные кровоизлияния в зародышевых оболочках, наличие гиперемии, гемоциркуляторных изменений, развитие перикардита, серозно-фибринозного аэросаккулита, перигепатита, катарально-фибринозного энтероколита, гиперплазии  селезенки. При витальном исследовании продукции токсинов с применением  лабораторной модели «проницаемость сосудов» исследуемую жидкость вводили интраназально 5-суточным цыплятам породы «Белый леггорн», через 24 ч внутривенно вводили раствор красителя «синего Эванса», не проникающего через неповрежденный эндотелий кровеносных сосудов, результаты оценивали, сравнивая разность массы легких опытных и контрольных животных – тест «проницаемость сосудов». При наличии  токсинов бактерий коэффициент проницаемости кровеносных сосудов  колебался  в пределах  от 1,09±0,11 до 1,24±0,14. Действие токсинов P. aeruginosa на ткани и органы цыплят и лабораторных мышей характеризовалось  преобладанием процессов, развивающихся по типу реакции гиперчувствительности замедленного типа, токсической дистрофией кардиомиоцитов, кровоизлияниями и  застойной гиперемией, лимфоидно-клеточной инфильтрацией рыхлой волокнистой соединительной ткани, периваскулярным отеком тканей, образовавшимся вследствие выхода плазмы и форменных элементов крови, диссеминированным тромбозом.  В тимусе отмечали признаки расстройства кровообращения, атрофические  процессы,  акцидентальную трансформацию, характеризующуюся уменьшением долек, исчезновением коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговое вещество и формированием кист. На начальном этапе экспериментальных исследований (24-32 ч после введения токсина) признаки скопления значительного количества серозно-геморрагического экссудата в просвете желудочно-кишечного тракта, сочетание общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями собственного слоя слизистой оболочки, лимфоидной инфильтрацией ворсинок тонкого отдела кишечника28, скоплением плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами тканей и органов иммунной, сердечно-сосудистой, дыхательной системы, лейкоцитарной  инфильтрацией и пролиферацией фибробластов перибронхиальной и периваскулярной  рыхлой волокнистой соединительной ткани.

При исследовании межвидового антагонизма наряду с общепринятыми методами исследования, были апробированы методы с использованием мембранных фильтров ( , 1994; , , 1998; и соавт, 2007). В результате исследований было установлено, что изоляты P. aeruginosa, угнетали рост бактерий S. typhimurium с зоной задержки роста 1,3±0,1 мм; S. enteritidis – 1,4±0,1 мм; K. pneumonia – 1,1±0,1 мм; C. freundii – 1,5±0,2 мм; E. coli – 2,0±0,2 мм; Y. enterocolitica– 1,5±0,2 мм. При сравнении методик оценки антагонистической активности микроорганизмов установлено, что из апробированных наиболее результативным является метод мембранных фильтров. Суть методики состоит в способности биологически активных веществ, продуцируемых бактериями-антагонистами, диффундировать через мембранные фильтры в слой питательной среды. После воздействия биологически активных веществ на поверхностях мембранных фильтров выявляется рост культуры бактерий в виде пятна различной плотности и величины. Для определения антагонистической активности микроорганизмов оптимальными в практических условиях являются методы с использованием мембранных фильтров, с помощью которых на хромогенных средах представляется возможным определять антагонистическую активность микроорганизмов, относящихся к разным систематическим группам. Кроме того, эти методики позволяют проводить количественно-качественную оценку степени ингибирования штамма-антагониста. Это расширяет познание о действии БАВ и показывает, что визуальное отсутствие роста бактерий не свидетельствует о результатах бактерицидного действия. Использование методик с мембранными фильтрами уменьшает время культивирования микроорганизмов, существенно снижает экономические затраты на питательные среды, т. к. на одной чашке Петри можно проводить исследования антагонистической активности 3-4 штаммов-антагонистов к 9-24 тест-культурам. Свойство бактерий продуцировать биологически активные вещества широко используется как один из экологически безопасных способов профилактики желудочно-кишечных инфекций сельскохозяйственных животных. Установлено, что БАВ действуют на патогенную микрофлору значительно дольше, так как продукты метаболизма продуцируются в процессе жизнедеятельности популяции в отличии химических агентов (дезинфицирующие и лекарственные препараты).

При определении чувствительности P. aeruginosa к антибиотикам использовали  ускоренный метод диффузии в агар по общепринятой методике, параллельно с классическими методами проводили определение антибиотикочувствительности микроорганизмов с помощью экспресс-теста «Гексадиски Pseudo 6» – набор из 6 одиночных дисков, радиально прикрепленных к центру. Для определения чувствительности микроорганизмов к АБП взвесь P. aeruginosa (106  КОЕ/мл) высевали  на поверхность МПА, приоткрытые чашки Петри подсушивали в течение 15 мин, раскладывали гексадиски, культивировали при 35° С в течение 20 ч, учет результатов в соответствии с методическими указаниями (МУК 4.2.1890-04: «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»). Из числа культур микроорганизмов Pseudomonas  aeruginosa, выделенных из пищевого сырья и продуктов, 79,8% чувствительны к антибиотикам группы в-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8% – аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин, нетилмицин), 88,4% – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); 58,1 % устойчивы к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.

Для обнаружения остаточных количеств антибиотиков в сырье и пищевых продуктах использовали тест-систему «Premi ® Test», принцип действия  которой основан на высокой чувствительности бактерий Bacilluss Stearothermophilus к антибактериальным препаратам.  Ампулы  «Premi ® Test» содержат твердую агаровую питательную среду, стандартное количество спор бактерий и цветной индикатор бромокрезол. При  культивировании  при 64°С споры прорастают. В отсутствие  АБП происходит размножение бактерий и выделение кислоты, в результате индикатор бромокрезол приобретает желтый цвет. При наличии в анализируемом образце АБП в концентрации, превышающей минимально обнаруживаемую, рост бактерий подавляется, кислотность среды остается близкой к нейтральной, бромокрезол придает содержимому ампулы фиолетовый цвет. Учитывая цвет пробы после культивирования, устанавливали положительный  или отрицательный  результат анализа. В результате  эксперимента установлено, что 25 исследуемых проб: из мяса птиц (n=5) 4 пробы были положительными, свинина (n=5) – 3 положительными,  говядина  (n=5) – 2 положительными, мясо рыбы  (n=5) – 4 положительными, креветки  (n=5) – 4 положительными. Устоновлено, что случаи выявления в пищевых сырья и продуктах животного происхождения остатков антибиотиков встречаются достаточно часто, наиболее всего подвержены загрязнению остаточными количествами антибиотиков в продуктах:  мясо птицы, свинина,  рыбы и креветки.

  Для изучения чувствительности бактерий к действию растворов желчи (-Мед», Санкт-Петербург) использовали метод диффузии в агар, установлено, что зоны  задержки роста бактерий составили  от 11,8 до 15,0 мм. При анализе результатов бактериостатического действия желчи уровень резистентности представителей изученных видов бактерий уменьшался в ряду: псевдомонады, клебсиеллы, протей, сальмонеллы,  эшерихии,  иерсинии. Экспериментальными исследованиями установлено, что  растворы желчи (1 – 4 %) оказывают бактериостатический эффект. Методом сканирующей электронной микроскопии установлено нарушение  структуры клеточных стенки и  переход популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации. Популяции таких клеток теряют патогенные свойства.  Для изучения морфологии популяций бактерий при воздействии антибактериальных препаратов на выживаемость и популяционную изменчивость перспективным является применение метода культивирования бактерий на мембранных фильтрах с последующим исследованием в сканирующем электронном микроскопе, позволяющего исследовать закономерный ответ бактериальной популяции на действие абиотических и биотических факторов (, , 1998; и соавт, 2007). Теоретическое обоснование действия растворов желчи состоит в том, что желчь обладает выраженными антиадгезивными свойствами,  следовательно, препятствует процессу адгезии  и колонизации патогенных и условно патогенных бактерий к поверхностям слизистой оболочки кишечника, предотвращая формирование бактериальных пленок. Указанные свойства растворов желчи испытаны для профилактики и лечения поросят в свиноводческих хозяйствах. Положительными качествами препаратов желчи является  экологическая безопасность, нетоксичность, доступность в применении (, ).