Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 9 )

Для определения чувствительности  микроорганизмов к антибиотикам макрометодом серийных разведений  0,5 мл рабочего раствор антибиотика вносили в пробирку, содержащую 0,5 мл 0,7 %-ного МПА. Процедуру повторяли  для приготовления ряда необходимых разведений. Для инокуляции использовали  взвесь микроорганизмов  – 106  КОЕ,  по 0,1 мл каждого разведения высевали в чашки Петри на поверхность плотной питательной среды, культивировали  при 35 °С в течение 24 ч.  Минимальную подавляющую  концентрация (МПК) определяли по наименьшей концентрации антибактериального препарата, подавляющей видимый рост микроорганизма.  При использовании микрометода  исследуемую культуру микроорганизмов (106 КОЕ) вносили в лунки планшета, содержащие антибиотики, культивировали  при 35 °С в течение 24 ч. Учет результатов проводили спектрофотометрически, сравнивая рост микроорганизмов в  лунке, содержащей  антибиотик, с отрицательным контролем.  Преимуществом микрометода является высокая производительность и возможность длительного хранения планшет.

  При  использовании метода серийных разведений в агаре исследуемую  культуру  микроорганизмов (104 КОЕ) высевали на чашки Петри с агаром, содержащим последовательные разведения антибиотика. Параллельно для контроля роста производили посев на агар, не содержащий антибиотики,  культивировали при 35 °С в течение  24 ч, затем  определяли МПК препарата.

Методы определения чувствительности к дезинфицирующим средствам. Исследования по устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам проводили в соответствии с методическими указаниями «О порядке испытания новых дезинфицирующих средств для ветеринарной практики» (М., 1987), «Проведение дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора» (М., 2002).

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам на первом этапе исследования проводили методом диффузии в агар (, 1956).  В плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки). В них заливали дезинфицирующее средство в различных концентрациях, а поверхность агара контаминировали суточными культурами тест-микроорганизмов. Чашки Петри культивировали в  термостате при  37 °С в течение 2 суток. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур вокруг лунок после культивирования. Наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы «Дип-слайды», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, а затем помещали в контейнер и культивировали при 37 °С 18-24 ч. При бактериологическом контроле качества дезинфекции определяли наличие на поверхностях обеззараживаемых объектов жизнеспособных клеток санитарно-показательных микроорганизмов-бактерий группы кишечной палочки (Escherichia, Citrobacter, Enterobacter), S. aureus, S. epidermatis,  S. saprophiticus, микобактерий или спорообразующих аэробов рода Bacillus. Пробы отбирали стерильными ватно-марлевыми тампонами, смоченными в стерильном нейтрализующем растворе или воде. Участки площадью 10х10 см тщательно протирали до полного снятия с поверхности всех имеющихся на ней загрязнений, после чего тампоны помещали в пробирку с нейтрализующей жидкостью. Для индикации  E. coli 0,5 мл центрифугата высевали в пробирки со средой Кесслера. Посевы культивировали 12-18 ч при 37 °С. Для индикации стафилококков 0,5 мл центрифугата высевали в 5 мл мясо-пептонного бульона с 6,5 % хлористого натрия. Через 24-48 ч культивирования посевов при 37 °С делали пересевы бактериологической петлей на 8,5% солевой мясо-пептонный агар. Посевы выдерживают в термостате 24-48 ч при 37 °С.  Из выросших культур для подтверждения роста стафилококков готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали. Для индикации спорообразующих аэробов из центрифугата каждой пробы делали посевы в одну пробирку с мясо-пептонным бульоном (МПБ) и на две чашки с мясо-пептонным агаром (МПА). Посевы культивировали 24-48 ч при 37 °С.

2. 5. Методы статистической обработки результатов исследований

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке общепринятым методом (, , 1962; , 1975). Статистическую ошибку средней арифметической (m) определяли по формуле: m = К·Уа, где К – константа Молденгауэра;  Уа – сумма отклонений вариантов от средней арифметической. Константа Молденгауэра рассчитана по формуле: , где n - число повторности.

Коэффициент достоверности средней арифметической (t) для одного вариационного ряда определяли по формуле:

Коэффициент достоверности различий средних величин двух вариацион­ных рядов вычисляли по формуле:

=

По величине td судили о достоверности, основываясь на связи этой величины с уровнем вероятности (Р), по таблице Стьюдента-Фишера.

Коэффициент корреляции вычисляли с использованием компьютерной программы «SPSS» и «Statistika» (StatSoft, Inc.).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты исследований морфологии колоний

бактерий Pseudomonas  aeruginosa

При культивировании бактерий P. аeruginosa на МПА, «CN agar» «Cetrimide agar» через 18 – 48 ч при 37 °С выявило формирование S-R-M форм колоний. S-формы колоний имели округлую форму, были прозрачными, с ровными краями, d=2,0-5,0 мм;  R-формы – плоские неправильной формы, складчатые, непрозрачные, с шероховатыми  краями, d≥3,0 мм; карликовые, d≤1,0 мм; М-формы –  мукоидные (слизистые), d=1,5 – 3,0 мм  (табл. 5).

Таблица 5

Морфология колоний P. aeruginosa

Морфология  колоний	Частота встречаемости, %
«МПА»	«CN agar»	«Cetrimide agar»
S-формы:  круглые, прозрачные	50,1	6,2	88,0
R-формы: - плоские неправильной формы	33,4	3,1	7,2
- складчатые	8,4	0	4,8
- карликовые	0	36,5	0
М-формы: мукоидные (слизистые)	6,7	54,2	0

Для изучения морфологии колоний препараты фиксировали в течение 3 мин в этиловом спирте, после подсушивания на поверхность колонии наносили 3 – 5 капель 1,0 %-ного водного  раствор метиленового синего или водного раствора кристаллвиолета в разведении 1:2000. Для сохранения естественной архитектоники колоний препараты фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30 – 40 мин, для контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали  коричневый цвет.

Для исследования колоний бактерий при сканирующей электронной  микроскопии применяли метод культивирования бактерий на мембранных фильтрах «Владипор, №5, №2», фиксировали парами 25,0 % раствора глутарового альдегида в течение 30-40 мин, для дополнительного контрастирования применяли пары 1,0 % раствора осмиевой кислоты (OSO4) в течение 1–2 мин, после обработки колонии приобретали темно-коричневый цвет, что позволило подсчитывать количество колоний, в том числе очень мелких (≤1,0 мм). При изучении морфологии популяции бактерий без нарушения архитектоники колоний выявили морфологические изменении на уровне популяции бактериальных клеток, что связано с диссоциацией, частичной или полной потерей бактериями клеточной стенки, разрушением предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ферментативной системы. При благоприятных условиях нестабильные L-формы способны реверсировать в исходное состояние, так, через 7–10 суток реверсировавшие культуры визуально формировали  нетипичный рост мелких, уплощенных закрытых тонкой слизистой биопленки. При нарушении  структуры бактериальных клеток и  перехода популяции P. aeruginosa в гетероморфизм с различными проявлениями L-трансформации образуются сферопласты или протопласты округлой формы различной величины, а также нестабильные и стабильные L-формы. Разработанная методика изучения популяции бактерий без нарушения архитектоники колонии, позволила выявить морфологические изменении на уровне структуры бактериальных клеток  P. aeruginosa, проявляющаяся  диссоциацией на S-, R-, М-формы колоний: S-формы  имели типичную для вида палочковидную форму и гладкие края колоний; у R-форм наряду с типичными для данного вида  бактериями по морфологическим критериям выявлен гетероморфизм; М-формы представлены сливными слизистыми колониями под массивными покровами (биопленками). 

3. 2. Результаты изучения дифференциально-диагностических свойств бактерий Pseudomonas aeruginosa

Для подбора эффективных дифференциально-диагностических сред изучали ростобеспечивающие, ингибирующие свойства, специфичность сред:  «Hugh Leifson Medium»;«Mac Conkey аgar»; «Hi Chrom Medium»; «CN agar» и «Cetrimide agar» культивировали  24 – 48 ч при 37 °С. При оценки ростообеспечивающих свойств сред взвесь микроорганизмов, содержащих около 1000 бактериальных клеток в 1 мл (стандарт мутности ГИСК им. ), высевали по 0,1 мл на поверхность сред, среднее количество колоний P. aeruginosa составило  64,15±1,35 – 81,33±1,63; энтеробактерий 42,17±1,37 – 90,17±1,47 (табл. 6).