Дифференциально-диагностические свойства и чувствительность к антибактериальным препаратам бактерий Pseudomonas aeruginosa (стр. 13 )

Таблица 14

Результаты изучения чувствительности P. аeruginosa к антибиотикам методом серийных разведений

Антибиотики	P. аeruginosa*	P. аeruginosa**	P. аeruginosa ***
МИК min, мг/г	МИК min, мг/г	МИК min, мг/г
Цефтазидим	1,0	4,0	2,0
Цефепим	2,0	4,0	4,0
Имипенем	1,0	1,0	1,0
Меропенем	0,5	1,0	1,0
Гентамицин	1,0	4,0	2,0
Амикацин	1,0	32,0	32,0
Ципрофлоксацин	0,063	0.125	0.125

Примечание: * – референтный штамм; **  –  фарш птиц; *** –  рыбы

Для обнаружения остаточных количеств антибиотиков в сырье и пищевых продуктах использовали тест-систему «Premi ® Test», основанный на высокой чувствительности бактерий Bacilluss Stearothermophilus к антибактериальным препаратам.  Ампулы  «Premi ® Test» содержат твердую агаровую питательную среду, стандартное количество спор указанных бактерий и цветной индикатор бромкрезол, при  культивировании  при 64°С споры прорастают. Из исследуемых проб (n=25), используя пресс, выдавливали около 250 мкл сока. В ампулы «Premi ® Test» добавляли 100 мкл исследуемых образцов и оставляли на 20 минут при комнатной температуре для предварительной диффузии; промыли пробирку деминерализованной водой, осторожно отбирали воду из ампулы, закрывали пробирку фольгой, предварительно доводили температуру нагревательного блока до 64°С, поместили пробирку в инкубатор на 3 часа, затем извлекали пробирку из нагревательного блока и помещали пробирку в сканер «Premi®Scan». Учет результатов проводили по изменении цвета индикатора; «+» результат – при отсутствии в анализируемом образце АБП в концентрации, превышающей минимально обнаруживаемую, рост бактерий подавляется, кислотность среды остается близкой к нейтральной, бромокрезол придает содержимому ампулы фиолетовый цвет;  «-» результат – при отсутствии  в анализируемом образце АБП происходит размножение бактерий и выделение кислоты, в результате индикатор бромокрезол приобретает желтый цвет. При изучении наличия  АБП количество положительных результатов  от 40,0 до 80,0 % .

При изучении чувствительности к антибактериальным препаратам культуры микроорганизмов Pseudomonas  aeruginosa, выделенные из пищевого сырья и продуктов, 79,8% были чувствительными к антибиотикам группы в-лактам (цефоперазон, цефотаксим, цефепим, азтреонам, имипенем, меропенем); 51,8% – аминогликозидам (гентамицин, тобрамицин, нетилмицин), 88,4% – хинолонам (норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин); в то время 58,1 % были устойчивы к хлорамфениколу, тетрациклину, доксициклину.

3. 5. 2.  Результаты изучения антибактериальной активности

экстрактов  растений и желчи 

При изучении антибактериальной активности экстрактов растений установлено, что антибактериальной активностью по отношению к бактериям  P. аeruginosa обладали Коптис китайский (Coptis chinensis), Шлемник байкальский (Scutellaria baicalensis Georgi), зоны задержки роста  составили от 9,0±0,59 до 11,5±0,97; по отношению к изученным видам энтеробактерий обладали Японская жимолость (Honeysuckle aqueous), Коптис китайский, Шлемник байкальский, Чай Пуэр (Camellia sinensis var. assamica), зоны задержки роста от 9,0±0,64 до  13,0±1,1(табл.15).

Таблица 15

Результаты изучения антибактериальной активности

лекарственных растений, мм (М±m)

Культуры микроорганизмов	Зоны  задержки роста (мм) (М ± m)
Японская жимолость	Коптис китайский	Шлемник байкальский	Чай Пуэр
P.  аeruginosa	-	11,5±0,97	9,0±0,59	-
E. coli	10,0±0,83	13,0±1,1	11,0±0,91	10,0±0,83
C. freundii	9,2±0,75	12,0±1,0	10,0±0,83	10,0±0,83
Y. enterocolitica	9,0± 0,64	11,0±0,91	9,0±0,75	9,5±0,79

При сочетанном действии антибиотиков и экстрактов растения Коптис китайский зоны задержки роста P. аeruginosa составили от 19,50±1,54  до 25,50±2,12.

Для изучения чувствительности бактерий к действию растворов медицинской консервированной желчи (-Мед», Санкт-Петербург) использовали метод диффузии в агар,  для этого суспензию бактерий наносили пипеткой на поверхность чашки Петри с МПА в объеме 1,0 мл,  равномерно распределяли по поверхности шпателем. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Затем в чашках Петри на поверхностях  МПА пробойником делали отверстия (лунки), в которые вносили 1,0 – 4,0 % - ные растворы желчи, культивировали при 37 єС в течение 48 ч. При изучении чувствительности  P. aeruginosa к действию растворов желчи установлено, что зоны  задержки роста бактерий составили от 11,8 до 15,0 мм. При анализе результатов бактериостатического действия желчи уровень резистентности представителей изученных видов бактерий уменьшался в ряду: псевдомонады, клебсиеллы, протеи, сальмонеллы,  эшерихии,  цитробактеры, иерсинии. 

Для изучения антиадгезивных активности желчи к бактериям использовали методику, позволяющую сохранять естественную архитектонику при взаимодействии бактерий с клетками крови. В опыте использовали суспензию эритроцитов концентрацией 109 кл/мл в  физиологическом растворе и суточную бульонную культуру бактерий в концентрации 109кл/мл при воздействии желчи. Для изучении процессов адгезии P. аeruginosa к эритроцитам с использованием  оптической микроскопии, подсчитывали адгезированные бактерии на 25 эритроцитах для определения среднего показателя адгезии (СПА). Экспериментальными исследованиями установлена антиадгезивная активность растворов медицинской консервированной желчи, содержащей холевую и дезоксихолевую кислоты. Показано, что 1,0 – 4,0 % растворы желчи при экспозиции 2 часа снижали коэффициент адгезии бактерий в 4 раза.

3. 5. 3. Результаты изучения  чувствительности

Pseudomonas  aeruginosa к препарату «Дезант»

При исследовании чувствительности к дезинфицирующим препаратам микроорганизмов использовали методы диффузии в агар;  серийные разведения; для контроля качества дезинфицирующих препаратов применяли пластины «Дип-слайд» («Oxoid», Англия). Для изучения чувствительности микроорганизмов, выделенных из сырья и пищевых продуктов, использовали препарат «Дезант», содержащего 1,6,3,8-диметано-1,3,6,8-тетраазациклодекан – ЧАС по активному действующему веществу. На первом этапе исследования оценку чувствительности бактерий к указанному препарату проводили методом диффузии в агар.  Поверхность агара контаминировали суточными культурами тест-микроорганизмов, в плотной питательной среде пробойником делали отверстия (лунки), в которые заливали дезинфицирующее средство в различных концентрациях  (2,0 %, 2,5 %, 3,0 %). Чашки Петри культивировали при  37 °С в течение 2 суток. Результаты учитывали по наличию или отсутствию зон задержки роста культур микроорганизмов вокруг лунок после культивирования. На основании результатов исследований установлено, что зоны задержки роста микроорганизмов P. aeruginosa с 3% препаратом «Дезант» P. аeruginosa от 11,20±1,89  до 13,90±2,33 (табл. 16).

Таблица 16

  Результаты изучения чувствительности бактерий 

  к препарату «Дезант» методом диффузии в агар

Культуры микроорганизмов (источник выделения)	Зона задержки роста микроорганизмов, мм
Концентрация  препарата, %
2,0	2,5	3,0
P. аeruginosa1	10,70±2,31	11,00±1,76	13,90±2,33
P. аeruginosa2	10,30±1,83	10,80±2,30	11,20±1,89
P. аeruginosa3	10,90±2,17	13,80±3,10	12,20±2,44
P. аeruginosa4	12,20±2,55	12,10±1,78	11,30±1,34
P. аeruginosa5	13,40±2,11	12,00±1,74	13,60±1,85

Примечание: 1– референтный; 2 – фарш птиц; 3 – фарш свинины; 4 – фарш говядины; 5 – рыбы

При оценке чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующему препарату «Дезант», наряду с общепринятым методом диффузии в агар, нами были апробированы тест-пластины «Дип-слайд», предназначенные для бактериологического исследования поверхностей. Для бактериологического исследования применяли пластины «Дип-слайд» из полимера, находящиеся в стерильной прозрачной пластиковой пробирке (контейнер). Дифференциально-диагностические среды, размещенные на пластине, позволяли провести бактериологическое исследование материала с учетом цели исследования и биологии микроорганизмов, уменьшить объем  питательных сред и количество бактериологической посуды. «Дип-слайды» содержали следующие питательные среды: Цетримидный агар («Cetrimide agar») – селективный агар с цетримидом для выделения P. aeruginosa в различных образцах;  Мак Конки («Mac Conkey») – среда для выделения и дифференциации колиформных бактерий. При исследовании полимерную пластину слайда, покрытую плотной питательной средой, плотно прижимали к поверхности, помещали в контейнер и культивировали при 37 ° С 18-24 ч.  Изучение степени контаминации P. аeruginosa пищевых продуктов проводили методом отпечатков с использованием стерильных ватных тампонов. Для посева с использованием стерильных ватных тампонов, перед проведением исследования тампон увлажняли стерильным 0,1% водным раствором пептона или изотоническим раствором хлорида натрия. Смыв с объекта, тщательно раскатывали  ватным тампоном по поверхности агара  на «Дип-слайде».  Для посева методом отпечатка поверхность слайда с питательной средой плотно прижимали к исследуемой поверхности. После посева слайд помещали в контейнер с плотно закрывающейся крышкой, культивировали при 18–24 ч 37 °С.  Подсчитывали выросшие колонии микроорганизмов на поверхности питательной среды, определяли КМАФАнМ и учитывали степень контаминации бактериями поверхностей. Определение микроорганизмов основано на анализе морфологии и цвета образуемых колоний (при низкой концентрации бактерий посевы культивировали в течение 2 суток, затем оценивали морфологию). Метод индикации и идентификации псевдомонад с использованием пластин  «Дип-слайдов» позволял сократить время проведения эксперимента (поскольку посев на несколько сред происходит одновременно), расход питательных среды и расходные материалы на этапе первичного посева, облегчал транспортировку проб в лабораторию. «Дип-слайды» возможно использовать для проведения контроля качества дезинфекции, так как метод прост в исполнении, информативен, за счет комбинаций дифференциально-диагностических питательных сред, которые позволяли одновременно определить количество мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), псевдомонады и энтеробактерии.