Хронический гастрит у детей: механизмы развития, клинико-морфологическая характеристика, оптимизация терапии (стр. 2 )

Оценку результатов реакции связывания лектинов клетками слизь-образующего аппарата СОЖ проводили с учетом локализации зоны реагирования и интенсивности реакции. Зона реагирования определяла стадии формирования углеводной цепи гликопротеинов. Интенсивность реакции указывала на концентрацию рецепторов лектинов, что позволяло косвенно (полуколичественный метод) судить об уровне содержания олиго - и моносахаридов в составе цепочек гликопротеинов (, 1996; и соавт., 2006): 5-35% позитивных клеток /«+» – слабая степень, 40-65%/ «++» – умеренная; 70% и более/ «+++» – высокая степень.

Моноклональные (МКАТ) или поликлональные (ПКАТ) антитела, которые мы использовали в исследовании («Novocastra», Великобритания), были предназначены для работы с парафиновыми срезами (табл. 3).

Таблица 3

Панель антител, использованная в иммуногистохимическом исследовании

МKАТ / ПКАТ	Клон	Рабочее разведение
CD4	1F6	Ready to use
CD8	1A5	Ready to use
Immunoglobulin A Lyophilised Polyclonal	NCL-IgAp	1:200
Immunoglobulin M Lyophilised Polyclonal	NCL-IgMp	1:200
Immunoglobulin G Lyophilised Polyclonal	NCL-IgGp	1:200
Caspase-3 (CPP32)	JHM62	1:50
Ki-67	MM1	1:100
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)	EGFR.25	Ready to use
Transforming Growth Factor Beta Receptor1 (TGFR-β1)	8A11	1:100
MUC-5AC Glycoprotein	CLH2	1:70
MUC-6 Glycoprotein	CLH5	1:70
MUC-2 Glycoprotein	Ccp58	1:150
Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase 1 (TIMP1)	6F6a	1:150
Matrix Metalloproteinase 2 (MMP 2)	17B11	1:60
Matrix Metalloproteinase 9 (MMP 9)	15W2	1:30
«Novostain Universal Detection Kit»	NCL-D	Ready to use

Для иммуногистохимического исследования тканевые образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 18-24 часов, заливали в парафин по общепринятым методикам. Затем готовили гистологические срезы толщиной 4-5 мкм. Срезы помещали на покрытые силаном предметные стекла («DAKO», Дания), тщательно высушивали, депарафинировали, обезвоживали и отмывали в растворе трис-буфера при рН 7,2-7,4.

Вариант обработки депарафинированных срезов выбирали в зависимости от вида МКАТ/ПКАТ с учетом инструкций фирмы-производителя. С целью восстановления структуры антигенных детерминант на поверхности клеток, изменившихся в процессе фиксации ткани, гистологические срезы подвергали термической обработке в СВЧ печи при 950 в течение 30 минут в цитратном буферном растворе при рН 6,0.

После отмывки в буфере наносили пероксидазный блок в течение 5 минут, вновь промывали в буфере, наносили на препарат МКАТ/ПКАТ в рабочих разведениях и продолжали инкубацию в течение 60 минут при t = 370C. Для визуализации антигенреактивных клеток использовали тест-систему «Novostain Universal Detection Kit» («Novocastra», Великобритания). После окончания инкубации с первичными антителами препараты тщательно отмывали, обрабатывали сначала вторичными биотинилированными, затем третичными стрептавидиновыми антителами. По окончании 30 минутной инкубации при температуре 370 и тщательной отмывки антигенреактивные клетки визуализировали с помощью 3,3-диаминобензидина тетрахлорида в буферном растворе. Препараты докрашивали водным раствором гематоксилина в течение 30 секунд, а с целью получения подсинивающего эффекта обрабатывали в растворе 37мМ аммония. После редегидратации в спиртах препараты осветляли в 2 объемах ксилола и заключали в канадский бальзам.

При просмотре препаратов на светооптическом уровне антиген-позитивные клетки идентифицировали по их коричневому окрашиванию. Использование каждого вида МКАТ сопровождалось постановкой контрольных реакций. Иммуноморфологическую оценку препарата начинали с просмотра негативного контроля. В случае отсутствия окрашивания, в том числе и фонового, приступали к анализу исследуемого материала.

Для оценки пролиферативной активности эпителиоцитов желудка учитывали интенсивность экспрессии маркера Ki-67, который метит ядра клеток в G1 -, G2 - и S-фазу митотического цикла. Активность апоптоза в биоптатах слизистой оболочки желудка изучали с помощью иммуногистохимического исследования экспрессии белка СРР32. Клетки воспалительного инфильтрата слизистой оболочки желудка иммунофенотипировали с использованием МКАТ к CD4-, CD8-, IgA-, IgМ- и IgG-антигенам.

Для маркеров CD4, CD8, IgA, IgМ и IgG, Ki-67, CPP32 в 10 полях зрения (площадь поля зрения при об. 90 и ок. 8 составляет 994,5 мкм2) подсчитывали количество клеток, дающих интенсивное связывание пероксидазы в 1 мм2 по E. Savilahti (1972). Морфометрические исследования проводили с помощью объект-, окуляр-микрометра, морфометрической сетки и метода точкосчетной объёмометрии ( 1980; , 1990, 1999).

Кроме того, для объективной оценки интенсивности процессов клеточного обновления в СОЖ вычисляли индекс пролиферации (ИП - экспонирование клетками Ki-67 антигена), индекс апоптоза (ИА - экспонирование клетками СРР32-антигена), как процентное отношение числа иммуногистохимически-позитивных эпителиоцитов к общему числу подсчитанных эпителиальных клеток. Обычно просматривали от 100 до 300 эпителиоцитов. Применяли систему компьютерного анализа цветового изображения «Диаморф-цито» (Россия). Количество выполненных иммуногистохимических исследований представлено в таблице 4.

Просмотр и фотографирование микропрепаратов осуществляли на микроскопе Axioplan 2 («Carl Zeiss Jena», Германия) с использованием цифровой фотокамеры («Carl Zeiss Jena», Германия).

Таблица 4

Количество выполненных иммуногистохимических исследований

МKАТ / ПКАТ	ХГ Нр(+)	ХГ Нр(-)	ФД
CD4	52	24	20
CD8	52	24	20
Immunoglobulin A Lyophilised Polyclonal	52	24	20
Immunoglobulin M Lyophilised Polyclonal	52	24	20
Immunoglobulin G Lyophilised Polyclonal	52	24	20
Caspase-3 (CPP32)	48	20	20
Ki-67	48	20	20
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)	48	20	20
Transforming Growth Factor Beta Receptor1 (TGFR-β1)	48	20	20
MUC-5AC Glycoprotein	40	20	16
MUC-6 Glycoprotein	40	20	16
MUC-2 Glycoprotein	40	20	16
Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase 1 (TIMP 1)	60	20	10
Matrix Metalloproteinase 2 (MMP 2)	60	20	10
Matrix Metalloproteinase 9 (MMP 9)	60	20	10

Примечание: ХГНр(+) – ХГ H. pylori-ассоциированный; ХГНр(-) – ХГ H. pylori-ассоциированный.

Статистический анализ материала начинался с определения типа изучаемых переменных. При нормальном типе распределения в качестве основных характеристик описательной статистики использовались средняя арифметическая и стандартное отклонение (δ).

В том случае, если распределение в группах исследования отличалось от нормального, указывались Ме, нижний 25-й (L) и верхний 75-й (H) квартили ( 2000). При нормальном распределении количественных переменных двух групп применялся t – критерий Стьюдента с вариантами для связанных (группы пациентов до и после проведения эрадикационной терапии) и независимых (контрольная группа до лечения) выборок (различия считали достоверными при р<0,05). Для сравнения качественных признаков количественно малых групп применяли точный критерий Фишера (четырёхпольная таблица, одно-или двувариантный) (различия считали достоверными при р<0,05). При множественном сравнении (3 группы) вводился поправочный коэффициент Данета, который составил κ=0,05×3=0,15 ( 1999). Вариационный анализ в случаях распределения ненормального типа осуществляли с помощью критериев Смирнова-Колмогорова и Манна-Уитни – для двух независимых выборок (при сравнении количественных параметров), Вилкоксона (W) –для двух связанных выборок. Статистическое измерение связи (силы и направления) проводилось путём вычисления коэффициента корреляции рангов Спирмена (ρ). Для расчетов использован статистический пакет лицензионных программ Microsoft Excel, Statistica 6,0 для операционной системы Windows XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Распределение детей по полу в анализируемых группах пациентов было относительно равномерным. При изучении возрастного состава наблюдаемых детей нами зарегистрированы некоторые особенности. Так, частота H. pylori-ассоциированного ХГ у пациентов обоего пола постепенно нарастала до 10-летнего возраста, на протяжении следующего года жизни снижалась с формированием повторного пика в 13 лет у девочек и в 14 лет – у мальчиков. Средний возраст пациентов, страдающих ФД, составил 11,03±2,9 лет, при Н. pylori-ассоциированном ХГ – 11,50±2,13 лет, при Н. pylori-негативном ХГ– 12,65±1,92 лет.

Наиболее интенсивные боли в животе отмечали пациенты 1-й группы (р<0,05; t=2,37; д. и. 95 – 99%). Иррадиация боли в область поясницы либо в правое подреберье отмечалась только у пациентов с Н.pylori-ассоциированным ХГ (у 9 из 106). При ФД интенсивность боли была существенно меньше, чем при ХГ, наиболее частым провоцирующим её возникновение фактором было нервно-психическое напряжение (у 19 из 20 детей с этими жалобами).

У Н.pylori-позитивных больных синдром желудочной диспепсии был более выражен, чем у Н.pylori-негативных пациентов с ХГ и ФД (р1,2,3<0,05; t=2,28, д. и. 95 – 99%). Причем сочетание симптомов желудочной диспепсии наблюдалось достоверно чаще при Н.pylori-инфекции (р1,2<0,05; t=2,31, д. и. 95 – 99%).

В семьях детей группы Н.pylori-неассоциированного ХГ и ФД достоверно чаще, чем в 1-й группе (в 73,6% семей этих пациентов посуду мыли в тазу), соблюдались санитарно-гигиенические нормы: мытье посуды осуществлялось в проточной воде у 28 из 40 детей – 2-й группы и 30 – 3-й (р<0,001; t=5,92; д. и. – >99,9% и р<0,001; t=12,41; д. и. – >99,9%), вероятно, этому способствовал более высокий уровень образования родителей (у половины детей 2-й группы и у 18 из 30 – 3-й группы родители имели высшее образование в сравнение с 1-й – лишь у 20 из 106). В группе с Н.pylori-ассоциированным ХГ не придерживались определённого режима питания 100 больных (94,3%) из 106. Наиболее упорядоченным был пищевой режим в 3-й группе – у 2/3 пациентов (р1,3<0,001; t=6,7; д. и. – >99,9% и р2,3<0,001; t=5,3; д. и. >99,9%).

У ближайших родственников и родителей пациентов 1-й группы ХГ регистрировался достоверно чаще, чем другие заболевания желудочно-кишечного тракта (р<0,001; t=7,5; д. и. – >99,9%) и чаще, чем у родственников больных детей 2-й группы (р<0,001; t=2,60; д. и. >99%).

Глистная и/или протозойная инвазия гораздо чаще присутствовала у пациентов 2-й группы (у 22 из 40), чем у больных 1-й группы (у 29 из 106) и не выявлялась в группе контроля (р1,2<0,01 (t=2,76; д. и. 95 – 99%).

Более двух заболеваний органов пищеварительной системы имели,2%) пациентов 1-й группы и 18 из 40 детей 2-й группы. Таким образом, полиморбидность достоверно чаще регистрировалась у Н.pylori-позитивных пациентов (t=2,4, д. и. 95 – 99%).

У пациентов с Н.pylori-неассоциированным ХГ достоверно чаще (у 8 из 40), чем у больных с геликобактериозом (у 4 из 106), выявлялся хронический тонзиллит (р<0,05, t=2,5, д. и. 95-99%), причём в группе контроля это заболевание не выявлено.

Иммунограммы были выполнены 64 пациентам с Н.pylori-ассоциированным ХГ и 28 больным пациентам с Н.pylori-неассоциированным ХГ. ЦИК регистрировались значительно чаще у Н.pylori-позитивных пациентов, чем у больных 2-й группы (Ме=64,5 (47 – 97,5) иусл. ед. соответственно, р<0,005). При этом мелкие ЦИК обнаружены только у 12 больных Н.pylori-ассоциированным ХГ (р=0,033).

При исследовании адаптационных реакций (табл.5) видно, что их изменения являются типичными для ХГ, причем независимо от связи этого заболевания с Н.pylori.

Таблица 5

Адаптационные реакции у детей с хроническим гастритом и функциональной диспепсией

Реакция	Абс.	p
ХГНр(+) n=106	ХГНр(-) n=40	ФД
Тренировки	2	9	21*	р1,2<0,001; р1,3<0,0001; р2,3<0,0001
Активации (зона спокойной активации)	24	2	9	р1,2<0,001; р1,3>0,005; р2,3<0,005
Активации (зона повышенной активации)	7	0	0	-
Переактивации	6	11*	0	р1,2<0,005
Неполноценности напряжения	62*,**	12	0	р1,2<0,001
Стресса	5	6	0	р1,2>0,005
Всего	106	40	30

Примечание: р1,2,3 – ошибка и порядковые номера групп; *- различия достоверны при сравнении по горизонтали;** – различия достоверны при сравнении по вертикали.