Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 10 )

Ионизация и, как следствие, образование центров скрытого изображения в кристаллах бромистого серебра могут происходить под действием не только энергии радиоактивного распада, но и любой другой: химической (воздействие клеток на эмульсию), тепловой (хранение радиоавтографических препаратов при комнатной температуре), механической (сжатие эмульсии при быстром высыхании) и т. п. Зерна серебра, возникшие в таких случаях, получили название фона. Фон возрастает в эмульсии при длительном хранении, при неоднократном замораживании-размораживании.

Уничтожение фона проводят перед началом экспозиции эмульсии с препаратом, используя сильные окислители типа перекиси водорода.

Наличие окислителей в атмосфере, где проводится экспозиция, может приводить к реокислению уже восстановленных зерен серебра в центрах скрытого изображения. Этот процесс (обратный возникновению фона) называется регрессией изображения. Регрессия происходит при длительных экспозициях. Особенно во влажных камерах и при повышенной температуре; в атмосфере с высоким содержанием кислорода. Регрессии в большей степени подвержены мелкозернистые эмульсии, которые из-за мелкозернистости являются низкочувствительными и требуют длительных экспозиций.

Во избежание регресии изображения экспонирование проводят в холодильнике, в атмосфере углекислого газа и с использованием обезвоживающих агентов.

В образовании фона и регрессии изображения может быть повинен и сам цитологический препарат. Для их предотвращения радиавтографический препарат предпочитают окрашивать после проявления эмульсии. От красителя требуется, чтобы он хорошо вымывался из желатина. Если окраске подвергается препарат до нанесения эмульсии, то краситель предварительно необходимо проверить на химическую нейтральность.

С этой же целью клетки перед нанесением эмульсии иногда покрывают тонкими пленками, которые защищают эмульсию от химического воздействия препарата, но не мешают проникновению ионизирующих частиц. Особенно важно применение защитных пленок в электроно-микроскопической радиоавтографии, где используют низкочувствительные мелкозернистые эмульсии. При этом несколько снижается разрешающая способность метода, но это вынужденный копромисс.

Вопросы для самоконтроля

1. Радиоавтографические методы, основные этапы.

2. Требования, которые нужно учитывать при выборе вещества-

предшественника изучаемого синтеза в радиоавтографии.

3. Преимущества использования тимидина, меченного тритием в

радиоавтографии.

4. Период полураспада наиболее часто используемых изотопов в

радиоавтографии.

5. Каков период полураспада изотопа водорода - Н (трития)?

6. Характеристика α-, β- и γ- излучений.

7. Регистрация α-, β - частиц в радиоавтографии.

8. Можно ли различить радиоавтографы двух изотопов, если один

испускает α-, а другой - β - частицы?

9. Какую форму трека оставляют α – частицы в фотоэмульсии?

10. Какова длина пробега в фотоэмульсии у изотопа водорода -

³Н (трития)?

11. Ядерные эмульсии и их характеристика.

12. Какое соотношение бромистого серебра и желатина в ядерных

эмульсиях, используемых в радиоавтографии?

13. Каково число образующихся зерен серебра в фотоэмульсии при

использовании изотопа углерода (14С)?

14. Центры чувствительности и центры скрытого изображения в

радиоавтографии.

15. Регрессия изображения в радиоавтографии и как ее избежать.

16. Что такое фон в эмульсии, как от него избавиться в

радиоавтографическом исследовании?

17. Какие факторы могут вызвать появление фона в ядерных

эмульсиях при авторадиографии?

Раздел 4. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Иммуноцитохимические методы – это методы, основанные на использовании меченных антител для локализации компонентов (антигенов) ткани in situ. Основателями иммуноцитохимии принято считать группу исследователей, возглавляемых Альбертом Кунсом (Coons et al, 1941,1945; Coons, Kaplan, 1950). Именно они впервые получили антитела, меченные флуоресцентным красителем, и использовали для идентификации антигена на срезах ткани. Абсолютная специфичность реакции антиген-антитело дает возможность надежно идентифицировать компоненты ткани.

Первый флуоресцентный краситель, который был использован для коньюгации с антителами, - флюоресцеинизоционат, что, по-видимому, объясняется легкостью присоединения его молекул к антителам. При возбуждении соединений флуоресцеина светом l = 490 нм наблюдается яркая яблочно зеленая флюоресценция.

Развитие метода привело к появлению новых меток, например: родаминизотиоцианат (красный флюоресцентный краситель), стали использовать ферментативные метки. Первым ферментом была пероксидаза. Используют также щелочную фосфатазу и глюкозооксидазу. Конечные продукты реакций, катализируемых этими ферментами, путем специальной обработки можно сделать электронноплотными. Иногда для выявления иммуноцитохимической реакции на ультраструктурном уровне используют метки, сами по себе являющиеся электроноплотными, например коллоидное золото.

Разработана методика мечения антител радиактивными элементами, в этом случае взаимодействие с антигеном регистрируют при помощи радиоавтографии.

Получение антител

Антитела, которые представлены главным образом g - глобулинами, получают при иммунизации кроликов (морских свинок) антигеном. Антиген должен быть совершенно чистым, (так как только в этом случае можно рассчитывать на получение специфических антител) или синтетическим.

Тем не менее, полученная сыворотка будет реагировать не только с молекулами антигена, введенного животным, но также с различными частями этих молекул, белком-носителем или его фрагментом. Сыворотка животного-донора содержит также множество естественных антител, которые могут реагировать с компонентами исследуемой ткани. Поэтому необходимо ставить строгий контроль и делать заключение, что обнаруживаемая иммунная реакция есть следствие специфического взаимодействия нужного антигена с антителами.

Если молекулы антигена большие (иммуноглобулины) – их используют непосредственно для иммунизации. Если же молекулы антигена маленькие (многие пептиды) или не обладают антигенными свойствами сами по себе; то при иммунизации их необходимо вводить с большими молекулами. Маленькую молекулу (гаптен) химически присоединяют к большой белковой молекуле-носителю (например, бычьему сывороточному альбумину). Такой комплекс лучше стимулирует образование антител. В этом случае сыворотка животного донора будет содержать смесь антител, способных реагировать с разными участками аминокислотной цепи гаптена и молекулы-носителя. При этом антитела, узнающие носитель, либо просто не окрашивают исследуемую ткань, либо при необходимости могут быть удалены адсорбцией. Для этого к сыворотке добавляют белок, выполняющий функцию носителя (например, бычий сывороточный альбумин). По прошествии определенного срока с момента первичной иммунизации (обычно подкожной) кролику делают вторичную инъекцию антигена, после этого берут кровь для проверки на присутствие антител. Отобранную кровь центрифугируют для осаждения эритроцитов. Антитела остаются в плазме, которая строго говоря не является сывороткой (так как содержит нити фибрина), но все же препарат антител принято называть антисывороткой.

Тестирование антител – проверка на наличие антител в сыворотке. Тестирование проводят при помощи ферментного иммуносорбентного метода (ELISA – Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent Assay); путем радиоиммунологического анализа (RIA), однако самый лучший – это окрашивание заведомо «положительной» ткани (иммуноцитохимический метод). При иммуноцитохимическом методе тестирования можно сравнить специфическое окрашивание с фоном. Если фоновое окрашивание слишком сильное – использовать сыворотку нельзя. Этот анализ предпочтителен потому, что позволяет оценить авидность (липкость) антител. Антитела должны прочно связываться с антигенами, иначе могут быть вымыты из ткани в процессе ее окрашивания.

Моноклональные антитела

Проводят иммунизацию мышей, затем лимфоциты селезенки (клетки синтезирующие антитела) сливают с культивируемыми клетками мышинной миеломы. После слияния гибридные клетки продолжают расти и делиться в культуре и синтезировать антитела. Одна клетка продуцирует только один тип антител, поэтому в результате клонирования удается получить клеточную линию, секретирующую одинаковые антитела. Отбор нужных клонов проводят анализируя культуральные жидкости на присутствие антител при помощи RIA, ELISA, иммуноцитохимически. Таким образом, удается отобрать моноклональные антитела, узнающие отдельные участки молекулы.

Моноклональные антитела хорошо хранятся. Смесь моноклональных антител, направленных к разным участкам молекулы, могут служить надежным иммунокрасителем. Моноклональные антитела используют не только, когда требуются чистые антитела к известному антигену, но и к неизвестным антигенам, которые могут служить маркерами определенных типов клеток и клеточных компонентов. Например: мышей иммунизировали тимоцитами человека, в результате клонирования был получен набор антител к Т-лимфоцитам человека. Эти антитела используют для иммуноцитохимического разделения клеток, принадлежащих к различным типам. Антитела узнают какие-то компоненты клеточной мембраны, однако химическая природа антигенов неизвестна.

Свойства хороших антител

1. Высокое сродство к антигену. Узнающие участки молекулы антитела должны быть хорошо подогнаны к антигенным участкам молекулы его специфического антигена, и при этом узнавать другие антигены.

2. Высокая авидность (сила связывания, липкость).

3. Высокий титр (разведение, концентрация антител). При высоком титре, за счет сильного разведения сыворотки во время окрашивания ткани, загрязняющие антитела могут быть выведены из реакции. В случае РИА, где разведение в 10 000 раз выше, чем при иммуноцитохимическом подходе, антитела взаимодействуют практически только со специфическими антигенами и побочные реакции неосуществимы.

Условия, необходимые для проведения иммуноцитохимического исследования: