Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 5 )

Главным достоинством методов, основанных на применении флуорохромов, является их высокая чувствительность, превышающая на порядок методы, использующие нефлуоресцентные красители. Использование флуорохромов позволяет выявлять вещества, находящиеся в клетке в очень низких концентрациях. Флуорохромы незаменимы при прижизненном изучении клеток, так как их можно вводить в клетку в очень небольших количествах.

Флуоресцентные красители в некоторых случаях оказываются более предпочтительными в количественных фотометрических исследованиях, поскольку позволяют избежать ошибки распределения. В соответствующих условиях свет флуоресценции пропорционален только количеству вещества и не зависит от его распределения.

М е т а х р о м а з и я

При окрашивании некоторых клеточных компонентов спектр поглощения комплекса краситель – вещество может отличаться как от спектра поглощения самого красителя, так и от спектра поглощения других окрашенных веществ клетки. Это явление получило название метахроматическое окрашивание (метахромазия). В отличие от отортохроматичского окрашивания, когда спектр поглощения комплкса краситель-вещество совпадает со спектром поглощения самого красителя. В результате появляются отчетливо выраженные цветовые контрасты.

Метахромазию можно получить при использовании многих красителей, в том числе и флуоресцирующих (толуидиновый синий, метиленовый синий, азур II, основной фуксин, судан черный, акридиновый оранжевый).

Механизм возникновения метахромазии становится понятным при изучении поглощения растворов красителя разной концентрации. Так, растворы акридинового оранжевого низкой концентрации дают зеленую флуоресценцию. При повышении концентрации красителя в растворе возникают димерные ассоциаты, для которых характерно красное свечение. Это свойство акридинового оранжевого нашло применение при установлении степени нативности ДНК (зеленая флуоресценция в отличие от красной флуоресценции РНК и денатурированной ДНК).

Детальный анализ эффекта возникновения метахромазии был проведен для толуидинового синего. Показано, что в растворах разной концентрации он может существовать в мономерной (a-), димерной (b-) и полимерной (g-) формах. a-форма дает синюю окраску, b-форма – фиолетовую и g-форма – красную. Фиолетовое окрашивание может появляться как в результате преобладания b-формы, так и при одновременном присутствии красителя в a- и g-формах.

Метахроматическое окрашивание может достигаться взаимодействием молекул разных красителей. Например, дифференциальность окрашивания хромосом красителями Гимза или Романовского определяется именно тем, что в разных участках хромосом формирование красящего комплекса происходит по-разному. Метиленовый синий (или азур) взаимодействует с ДНК за счет ионных связей с частичным интркалированием. В тех местах хромосом, где ДНК наиболее доступна для тиазиновых красителей, возникает их высокая концентрация, и они начинают взаимодействовать между собой через молекулы эозина, что приводит к возникновению дифференциального окрашивания.

Специфичность выявления внутриклеточных веществ

Специфичность взаимодействия красителя с веществом – необходимое условие проведения цитохимической реакции. Методов, в которых специфичность определяется непосредственным специфичным взаимодействием красителя с веществом, не очень много. Среди них можно назвать метод Браше, основанный на применении метилового зеленого с пиронином – смеси двух основных красителей, взаимодействующих с остатками фосфорной кислоты и используемых для дифференциального выявления ДНК и РНК. ДНК окрашивается метиловым зеленым в сине-зеленый цвет, РНК – пиронином в розовый цвет. Причем настоящей специфичностью обладает лишь метиловый зеленый, а пиронин окрашивает как РНК, так и ДНК. Однако интенсивность его взаимодействия с ДНК много ниже, чем с РНК. При одновременном использовании двух красителей слабо-розовый цвет комплекса ДНК-пиронин полностью маскируется интенсивным сине-зеленым цветом связанного с ДНК метилового зеленого. Другими словами, это тот случай, когда краситель хотя и не обладает абсолютной специфичностью, тем не менее успешно используется для цитохимической идентификации вещества.

Очень часто специфичность окрашивания обуславливается не самим красителем, а зависит от способа предварительной обработки материала. Примером такого красителя может служить реактив Шиффа, используемый для выявления самых разных веществ. Наиболее известны реакция Фельгена для обнаружения ДНК и ШИК-реакция на полисахариды.

Основой реактива Шиффа является парарозанилин (основной фуксин) – представитель трифенилметановых красителей. В ходе приготовления реактива Шиффа к водному раствору парарозанилина красного цвета добавляется сернистая кислота и раствор становится бесцветным (парарозанилин превращается в лейкофуксин). В такой форме краситель очень легко вступает в реакцию с двумя альдгидными группами с образованием соединения пурпурного цвета.

В зависимости от условий предварительной обработки клеток альдегидные группы будут выявляться в разных классах веществ.

1. Реакция Фельгена - для обнаружения ДНК используют мягкий кислотный гидролиз в соляной кислоте, который приводит к возникновению альдегидных групп на месте отщепившихся пуриновых оснований.

2. ШИК-реакция - для выявления полисахаридов используют специфичное взаимодействие йодной кислоты или ее солей с 1,2- гликолевыми группами в остатках глюкозы.

3. Реакция с белками происходит после обработки их нингидрином или аллоксаном, которые реагируют со свободными NH2 –группами аминокилот с образованием альдегидных групп.

4. Ненасыщенные липиды вступают в реакцию с лейкофуксином после обработки надмуравьиной кислотой.

По аналогии с фуксинсернистой кислотой можно привести множество других примеров. Так, одни и те же соли тетразолия применяются для выявления активности самых разных НАД - или НАДФ - зависимых дегидрогеназ, при этом специфичность реакции зависит от условий ее протекания и используемого субстрата. Бесцветная соль тетразолия при восстановлении превращается в ярко-окрашенный продукт – формазан, который указывает на локализацию и активность фермента.

Следует упомянуть большую группу методов, в которых специфичность взаимодействия обусловлена неокрашенными веществами, а уже к ним присоединена окрашенная или окрашивающаяся метка. Это прежде всего иммунофлуоресцентные методы анализа белков и методы гибридизации нуклеиновых кислот in situ с использованием биотина.

Специфичность может быть выражена в различной степени. Например, реакция Фельгена является специфичной в целом для ДНК, окраска акрихином позволяет идентифицировать участки, обогащенные АТ-парами, но только гибридизация in situ с мечеными фрагментами ДНК или РНК дает возможность локализовать конкретные нуклеотидные последовательности. Если говорить о белках, то методы их выявления, основанные на реакциях обнаружения определенных аминокислот, оказываются специфичными для всех внутриклеточных белков (хотя реакция на основные аминокислоты, благодаря их высокому содержанию в гистонах, позволяет идентифицировать этот класс белков отдельно). Уникальные белковые молекулы можно обнаружить, лишь применяя иммунологические методы.

Контроль специфичности окрашивания является обязательным этапом цитохимического анализа и предворяет проведение опыта или сопровождает его. Выбор контроля зависит от условий конкретной цитохимической реакции. Если специфичность реакции основана на выявлении определенной реакционноспособной группы (например, боковой - СООН-группы в аспарагиновой и глутаминовой кислотах), то контроль будет заключаться в блокировании этой группы (в данном случае с помощью метилирования).

При определении локализации и интенсивности ферментативной активности проверкой специфичности будет инкубация анализируемых клеток в среде без специфического для данного фермента субстрата.

Для контроля специфичности окрашивания можно применять избирательную экстракцию вещества. Экстракцию можно проводить ферментативную (при хорошей чистоте фермента и его высокой активности метод дает хорошие результаты) или химическую.

Метод дифференциальной экстракции используется не только для проведения контроля, но и имеет самостоятельное значение в цитохимии некоторых соединений. Например, метод обнаружения основных белков с помощью прочного зеленого требует предварительного экстрагирования РНК и ДНК трихлоруксусной кислотой, поскольку в условиях проведения реакции краситель взаимодействует не только с основными аминокислотами, но и с нуклеиновыми кислотами.

УФ-микроскопия нуклеиновых кислот (и в значительной мере электронная микроскопия) также связана с дифференциальной экстракцией, но на этот раз РНК.

Методы избирательной экстракции применяют в цитохимии липидов, возможности которой крайне ограничены из-за отсутствия специфических красителей.

Вопросы для самоконтроля

1. Виды препаратов в зависимости от способа их приготовления.

2. Какой из способов приготовления препаратов позволяет

определять неорганические вещества в клетке?

3. Ограничения прижизненного изучения клеток.

4. Какой прижизненный краситель используется для выявления

митохондрий?

5. Основная цель фиксации. Условия необходимые для успешной

фиксации.

6. При какой температуре фиксатора получаются самые хорошие

результаты?

7. Способы фиксации и их характеристика.

8. Основные фиксирующие жидкости и их характеристика.

9. Какие компоненты клетки фиксирует этиловый спирт?

10. Какой из фиксаторов можно использовать для фиксации

липидов в ткани?

11. Сущность метода замещения в замороженом состоянии.

12. Какое вещество используется для растворения кристаллов льда

при замещении воды в замороженных тканях?

13. Лиофилизация. Основные условия лиофильной сушки.

14. Основная характеристика физических способов фиксации.