Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 1 )

ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет»

Биологический факультет

Кафедра генетики

ЦИТОГИСТОХИМИЯ

Учебно-методическое пособие

Кемерово 2010

Составитель: , канд. биол. наук, доцент

Цитогистохимия: учебно-методическое пособие / сост. ; ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет».- Кемерово, 2010.- 76 с.

Учебно - методическое пособие «Цитогистохимия» разработано по курсу «Цитогистохимия» для специальности 020201.65 – Биология, по направлению 020200 – Биология.

В учебно-методическом пособии отражены принципы и основные этапы современных методов исследования клеток и тканей: аналитической микроскопии, биохимического анализа, радиоавтографии, иммуноцитохимии, спектрофотометрии. Особое внимание уделено достоинствам и недостаткам того или иного метода исследования.

Предназначено для студентов биологического факультета.

Утверждено на заседании Утверждено методической

кафедры генетики комиссией биологического

« 27 » августа 2009 г. факультета

« 4 » сентября 2009 г.

_____________ ____________

ВВЕДЕНИЕ

Учебно-методическое пособие «Цитогистохимия» знакомит студнтов с основными методами исследования клеток и тканей организма. Долгое время цитогистохимия развивалась в основном как аналитическая микроскопия. Только в середине 20 века появились и начали развиваться биохимические методы анализа фракций клеточных органелл, внесшие огромный вклад в изучение клетки. Современные представления о клетках и тканях основываются на достижениях не только аналитической микроскопии, биохимии, но и таких новейших методах исследования как иммуноцитохимический анализ, радиоавтография, проточная цитоспектрофотометрия.

Установление химического состава клеточных структур давно уже перестало быть самоцелью в цитогистохимии. Сегодня биолога интересует, прежде всего, функциональная организация клетки, механизмы становления и регуляции жизненно важных процессов.

Вмешиваясь в жизнь клетки, исследователь должен хорошо представлять достоинства и недостатки применяемого метода, понимать, что происходит при использовании тех или иных процедур, уметь выбрать адекватный метод для решения поставленной задачи.

Настоящее пособие не ставит целью глубоко и полно осветить все существующие цитогистохимические методы. Главная задача пособия – дать краткое систематизированное описание основных подходов к изучению химии клеток и тканей, и показать, какие трудности может встретить биолог-исследователь при анализе как собственных, так и литературных данных.

Учебное пособие «Цитогистохимия» может быть использовано студентами для самостоятельного изучения материала. В качестве дополнения для желающих более глубоко вникнуть в методы цитогистохимического анализа дается дополнительная литература.

Раздел 1. АНАЛИТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ

Основным объектом исследования в аналитической микроскопии являются гистологические препараты. Главным требованием к препарату, пригодному для микроскопического анализа, является его небольшая толщина: несколько микрометров для световой микроскопии и доли микрометра для электронно-микроскопического изучения.

В зависимости от метода приготовления цитологического препарата различают: о т п е ч а т к и клеток и тканей (например, селезенки, печени, тимуса), п л е н к и из ткани (например, соединительной или брюшины, мягкой мозговой оболочки или плевры), д а в л е н ы е препараты, м а з к и (например, мазок крови, костного мозга, слюны, спинномозговой жидкости), к л е т о ч н ы е с у с п е н з и и, с р е з ы.

Существуют и другие способы приготовления препаратов в цитохимии. Например, при исследовании неорганических веществ в клетке используют метод сподографии (микросжигания). Парафиновые или целлоидиновые срезы тканей сжигают в течение нескольких часов, постепенно повышая температуру до 500-550оС. Осторожное сжигание не вызывает деформации материала. Полученные сподограммы сохраняют морфологические особенности клеток. Их можно оценивать при помощи светового микроскопа, учитывая цвет золы; используя различные индикаторы или проводя дифференциальное растворение минеральных веществ. Сподограммы можно изучать и на электронно-микроскопическом уровне. Для этого золу дополнительно нагревают до 700-1000оС, она плавится. После охлаждения, зола переходит в кристаллическое состояние, и ее можно анализировать методом дифракции электронов.

Наибольшее распространение в цитохимии получило изучение

с р е з о в клеток и тканей. Их можно получать из свежезамороженного материала в криостате и, в зависимости от задач исследования, фиксировать разными способами или анализировать без фиксации. Можно получать срезы из материала, предварительно фиксированного и помещенного в специальную среду, облегчающую приготовление срезов.

Процесс изготовления гистологического препарата для световой и электронной микроскопии включает следующие основные этапы:

1.  Взятие материала и его фиксация.

2.  Уплотнение материала. Необходимо для приготовления срезов. Производится путем пропитывания предварительно обезвоженного материала парафином, целлоидином, органическими смолами. Более быстрое уплотнение достигается применением метода замораживания кусочков, например, в жидкой углекислоте.

3.  Приготовление срезов происходит на специальных приборах – микротомах (для световой микрскопии) и ультрамикртомах (для электронной микроскопии)

4.  Окрашивание срезов (в световой микроскопии) или контрастирование срезов (напыление их солями металлов: марганца, кобальта - в электронной микроскопии). Окрашенные препараты обычно обезвоживают в спиртах возрастающей крепости и просветляют в ксилоле, бензоле, толуоле или некоторых маслах.

5.  Заключение срезов в канадский бальзам или другие прозрачные среды (этот этап необходим только для световой микроскопии).

Прижизненное изучение локализации химических веществ

Изучение живых клеток и тканей in vivо или in vitro позволяет получить наиболее полную информацию об их жизнедеятельности. Одним из прижизненных методов исследования является наблюдение структур в живом организме с помощью специальных микроскопов. Другой самый распространенный метод исследования живых структур – изучение клеток и тканей в культуре (in vitro). Выделенные из организма человека и животных клетки, маленькие образцы тканей или органов помещают в стеклянные или пластмассовые сосуды, содержащие специальную питательную среду – плазму крови, эмбриональный экстракт и стимулятры роста клеток. Различают с у с п е н з и о н н ы е культуры (клетки взвешаны в среде) и м о н о с л о й н ы е культуры (эксплантированные клетки образуют на стекле сплошной слой). Обеспечивается стерильность среды и температура, соответствующая температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности – способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. В настоящее время получены клеточные линии фибробластов, миоцитов, эпителиоцитов, макрофагов, которые существуют многие годы.

Необходимо помнить о недостатках метода, которые необходимо учитывать при оценке полученных результатов. Изоляция клеток из целостного организма ведет к ряду изменений условий их существования: утрачиваются взаимосвязи с другими клетками и тканями, действие комплекса нейрогуморальных факторов регуляции. Для устранения этих недостатков применяют культивирование in vivо, когда образцы тканей и органов помещают в камеры из пористого материала, которые подсаживают в участок тела животного (в брюшую полость, под кожу)

При в и т а л ь н о м (прижизненном) окрашивании клеток и тканей краситель вводят в организм животного, при этом он избирательно окрашивает определенные клетки, их органеллы или межклеточне вещество. Например, трипановый синий или литиевый кармин выявляет фагоциты, ализарин - новообразованный матрикс кости.

С у п р а в и т а л ь н ы м окрашиванием называют окрашивание живых клеток, выделенных из организма. Таким способом выявляют молодые формы эритроцитов – ретикулоциты крови, используя краситель бриллиантовый крезиловый голубой, лизосомы при помощи нейтрального красного.

Однако возможности прижизненного изучения ограничены несколькими причинами:

1. Извлеченным из организма клеткам трудно создать условия, при которых они были бы доступны для микроскопирования и одновременно сохраняли нативность. По этой причине исключается электронно-микроскопический уровень исследования и, в значительной степени ограничивается круг объектов, изучение которых оказывается информативным (одноклеточные организмы, эпидермальные клетки растений, среди животных клеток - клетки в культуре тканей). Извлечение клеток из организма приводит к нарушению их химизма и, следовательно, к изменению локализации внутриклеточных веществ.

2. Серьезное ограничение связано с токсичностью большинства красителей, применяемых для идентификации клеточных компонентов (десятые, тысячные доли процента).

3. Еще одно ограничение обусловлено малочисленностью красителей, специфично связывающихся с веществами клетки. Один из известных - янус зеленый, окисляющийся в присутствии цитохромоксидазы, используется для идентификации митохондрий. Другой распространенный прижизненный краситель - акридиновый оранжевый, дает спицифическую зеленую флуоресценцию с нативной ДНК (в отличие от красной, возникающей при связывании красителя с РНК или денатурированной ДНК) и применяется для оценки состояния ДНК в клеточном ядре.

В последнее время все шире используют иммунофлуоресцентные, иммуноферментные методы, которые позволяют значительно расширить спектор клеточных веществ, доступных для прижизненного изучения.

Цитохимический анализ фиксированного материала

Главная цель фиксации заключается в том, чтобы убить клетку, сохранив ее в том состоянии, в котором она находилась при жизни. Это значит исключить посмертные изменения (автолиз), закрепить вещества в тех клеточных структурах, в которых они находились в живой клетке. Для этого их нужно перевести в нерастворимое состояние, причем необратимо (так, чтобы они не растворялись и не вымывались при последующих манипуляциях). Фиксация не должна препятствовать идентификации веществ.