Сигнал Ультразвуковой
флуоресценции генератор
 |
 |
Проточная Обтекающая
камера жидкость
 |
 |
Патрубок подачи
образца
Точка пересечения
лазерного пучка Струя жидкости
в воздухе, содержащая
клетки
 |
 |
Фильтр
Линза
детектора Сигнал
флуоресценции светорассеяния
Испускаемый свет
Линза детектора
светорассеяния
 |
Рассеянный свет
¡
Запирающая полоска
Лазерный
пучок ¡
+ ¡ -
+ - Точка отрыва капель
Отклоняющие + ¡ -
пласины + -
+ -
+¡+ -¡-
+ -
+
+¡+ ¡ -
+ -¡-
+ ¡ -
+¡+
+
 |  |
 | |
Рис. 9. Схематическое изображение лазерного сортировщика клеток.
оптимальное возбуждение молекул флуоресцеина, используемого для мечения антител. Если используется техника анализа по двум параметрам, то второй лазер фокусируется на струе жидкости несколько ниже точки пересечения лучом первого лазера. Этот второй лазер настраивают на длину волны 568 нм, вызывающую максимальное возбуждение молекул красителя техасского красного, кторый используется для промечивания антител при анализе по двум параметрам. Другие биологические красители, такие, как акрифлавин, митромицин, бромид этидия, йодид пропидия, характеризуются поглощением в пределах длин волн, испускаемых аргоновым лазером. С помощью этих красителей определяют содержание ДНК в индивидуальных клетках.
Клетки поступают в проточную камеру микрофлуориметра по трубке для подачи образца под давлением (Рис. 9), превышающим давление обтекающей жидкости. Клетки подхватываются ламинарным потоком обтекающей жидкости, и со струей выбрасываются из выходного отверстия проточной камеры. Когда клетка в токе жидкости пересекает лазерный луч, то он отклоняется. Такой рассеянный свет фокусируется линзой детектора светорассеяния и регистрируется на фотоумножителе (ФЭУ). Если клетка несет флуоресцентный краситель, то при пересечении лазерного пучка происходит испускание света (в результате возбуждения молекул красителя излучением лазера). Свет, испускаемый клеткой при возбуждении молекул красителя, проходит через фильтр, исключающий регистрацию лазерного излучения фотоумножителем детектора флуоресценции. Этот ФЭУ регистрирует излучение, испускаемое клеткой. На основе характеристик светорассеяния и флуоресценции может происходить сортировка клеток. С этой целью, под действием ультразвука на проточную камеру струя жидкости «разбивается» на капли. Эти капли могут быть избирательно заряжены при подаче заряда на струю жидкости непосредственно перед образованием капли. Если клетка обладает свойствами, соответствующими отклонению («селекции») в левом направлении, то на струю будет подаваться положительный заряд, как только клетка достигнет точки отрыва капель, и тогда положительно заряженная капля с соответствующей клеткой будет отклоняться влево при прохождении через заряженные отклоняющие пластины.
Вопросы для самоконтроля
1. Какое явление лежит в основе фотометрии?
2. Спектрофотометрический анализ клеток и тканей.
3. Закона Бугера-Бэра.
4. В каких пределах меняется оптическая плотность вещества?
5. В каких пределах изменяется оптическое пропускание?
6. Устройсто цитоспектрофотометра.
7. В чем суть фотографического способа регистрации светового
потока?
8. Методы фотометрии: многоточечный, сканирование,
двухволновой.
9. Какова ошибка измерения при использовании метода
сканирования в фотометрии?
10. Какие факторы влияют на количество красителя, связавшегося с
определяемым веществом (на примере ДНК-фуксина)?
11. Принцип действия проточного микрофлуориметра.
Рекомендуемая литература
1. Автондилов, морфометрия. - М.: Медицина,
1990.
2. Агроскин, Л. С., Папаян, . - Л.: Наука,
1977.
3. Биохимические основы жизнедеятельности человека: учеб.
пособие для студентов вузов / [, А. С.
Коничев, , ].- М.: Гуманитар.
Изд. центр ВЛАДОС, 2005.
4. Волкова, О. В., Елецкий, гистологии
с гистологической техникой. - М., 1982.
5. Иванов, красители в биологии.- М.: Наука,
1982.
6. Иммунология. / Под ред. У. Пола, М.: Мир, 1989.
7. Камышников, -биохимическая лабораторная
диагностика: Справочник: В 2-х т.-2-е изд. - Мн.:
Интерпрессервис, 2003.
8. Кисели, Д. Практическая микротехника и гистохимия. -
Будапешт, 1962.
9. Клиническая биохимия./ Под ред. .-М.:ГЭОТАР -
МЕД, 2002.
10. Кольман, Я., Рем, К.-Г. Наглядная биохимия. 2-е изд.: Пер. с
нем. – М.: Мир, 2004.
11. Комов, В. П., Шведова, : Учеб. для вузов - М.:
Дрофа, 2004.
12. Основы гистологии и гистологической техники. Под ред. В. Г.
Елисеева и др. / М.: «Медицина», 1967.
13. Пирс, Э. Гистохимия (теоретическая и прикладная). - М.:
Изд- во иностр. ли – ры, 1962.
14. Полак, Дж., С. Ван Норден Введение в иммуноцитохимию:
современные методы и проблемы. - М.: Мир, 1987.
15. Справочник биохимика: Пер. с англ. /
– М.: Мир, 1991.
16. Ташке, К. Введение в количественную цито - гистологическую
морфологию. - Румыния, 1980.
17. Хэм, А., Кормак, Д. Гистология. - М: Мир, 1983.
С О Д Е Р Ж А Н И Е
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………….......3
Раздел I. АНАЛИТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ………...........4
Прижизненное изучение локализации химических веществ…….5
Цитохимический анализ фиксированного материала …………...7
Химические способы фиксации …………………………………..8
Физические способы фиксации ………………………………….11
Уплотнение материала и приготовление срезов ………………..14
Общие принципы идентификации веществ в клетке ………….19
Метахромазия ……………………………………………………..24
Специфичность выявления внутриклеточных веществ ……......25
Раздел II. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……………………30
Гомогенизация клеток…………………………………………….30
Фракционирование………………………………………………..33
Анализ фракций…………………………………………………...38
Ультрамикрохимические методы ………………………………..40
Метод «циклирования» …………………………………………...43
Раздел III. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……...46
Включение изотопа………………………………………………..46
Распад изотопа с образованием ионизирующих частиц………..48
Фоторегистрация ионизирующих частиц………………………..51
Раздел IV. ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ……55
Получение антител………………………………………………..55
Моноклональные антитела………………………………………57
Иммунофлуоресцентные методы…………………………….......59
Иммуноферментные методы …………………………………….59
Метод «немеченных» антител……………………………………60
Пероксидаза-антипероксидазный метод ………………………..60
Комбинация иммуноцитохимии с другими
гистохимическими методами…………………………………….64
Раздел V. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ МЕТОДЫ ……………………65
Спектрофотометрия……………………………………………….65
Проточная цитофотометрия………………………………………69
Рекомендуемая литература……………………………………….74
ЦИТОГИСТОХИМИЯ
Учебно-методическое пособие
для студентов высших учебных заведений
Редактор
Подписано в печать 25.12.2009 г. Формат 60-84 1/16. Бумага офсетная №1. Печать офсетная. Печ. л. _5,0 Уч.-изд. л. ____
Тираж 100 экз. Заказ № _________
ГОУ ВПО «Кемеровский государственный университет», 2010
650043, Кемерово, ул. Красная, 6.
Отпечатано в типографии издательства «Кузбассвузиздат».
650043, Кемерово, ул. Ермака, 7.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 |
