Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 4 )

Для приготовления парафиновых срезов из затвердевшего парафина вырезают блок, который должен иметь широкое основание. Тщательно обрезанный блок наклеивают расплавленным парафином на деревянный кубик, который укрепляют в блокодержателе микротома и фиксируют непосредственно к столику микротома. Угол наклона ножа к поверхности объекта устанавливается в каждом случае опытным путем.

При изготовлении парафиновых срезов могут быть неудачи. Если парафин слишком мягкий, срезы будут сморщиваться; в этом случае парафиновый блок при резании надо охлаждать. При слишком твердом парафине срезы будут крошиться и скручиваться; чтобы избежать этого, нужно делать более тонкие срезы и подогревать блок, поместив около него электрическую лампочку.

Если блок правильно обрезан, то срезы ложатся на нож в виде ленты или серии. В тех случаях, когда на ленте образуется заметная продольная полоса или серия расщепляется, необходимо проверить лезвие ножа; обычно это явление связано с имеющимися на ноже зазубринами.

Получаемые срезы снимают с лезвия ножа мягкой кисточкой, смоченной в воде, или препаровальной иглой и переносят на предметное стекло в каплю теплой дистиллированной воды (предметные стекла располагаются на столике для расправления срезов с нагретой до 40º поверхностью). Срезы тотчас расправляются. Срезы кладут на воду той стороной, которая была обращена к ножу.

Предметные стекла с парафиновыми срезами высушивают в течение 24 часов в термостате при 37ºС. Для более прочного приклеивания парафиновых срезов предметные стекла предварительно необходимо смазать смесью белка с глицерином. Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят маленькую капельку смеси белка с глицерином и тщательно размазывают на стекле тонким слоем. Руки должны быть предварительно вымыты и обработаны спиртом. Нанесенный на предметное стекло тонкий слой смеси нагревают, для чего стекло проводят 2-3 раза над пламенем спиртовки. После такой обработки предметное стекло считается готовым и на него можно выкладывать парафиновые срезы.

Общие принципы идентификации веществ в клетке

Микроскопическую идентификацию клеточных веществ можно проводить, основываясь на их физико-химических свойствах и регистрируя результаты их биологической активности in vivo, in vitro или in situ. На светомикроскопическом уровне обычно анализируют спектры поглощения или излученя красителей, специфически связавшихся с клеточными компонентами, либо их собственные спектры поглощения или излучения. Примером другого подхода является выявление активности клеточных ферментов по регистрируемым продуктам реакции.

Светомикроскопический цитохимический анализ разработан для веществ, поглощающих свет в видимой части спектра и в ближней ультрафиолетовой области с длинами волн соответственно 400-750 нм и 240-400 нм.

Поглощение определяется веществами, содержащими углеродные цепочки, в которых чередуются двойные и одиночные связи. В таких цепочках возникает эффект сопряжения связей, конечным проявлением которого является оптическое поглощение. Эту систему, определяющую цвет вещества, называют хромофором молекулы. Чем более протяженна система сопряжения, тем в более длинноволновую область смещается оптическое поглощение и тем глубже цвет вещества. В основе наиболее распространенных хромофоров лежат хиноидные кольца и азогруппы (-N=N-). Хромофорная группа может содержать атомы тяжелых металлов (такие красители могут быть использованы в световой и в электронной микроскопии).

Разрыв цепи сопряжения за счет восстановления двойной связи приводит к повыщению цвета или даже его исчезновению. На этом свойстве основано действие индикаторов, у которых длина цепи сопряжения меняется в зависимости от рН среды.

Цвет вещества зависит не только от хромофора, но и от того, с какой электронодонорной или электроноакцепторной группой он связан. Введение электронодонорных (-ОН, - NН2) или электроноакцепторных (-NO2 , >C = NH, >C = O) групп в молекулу, содержащую хромофор, приводит к некоторому смещению заряда в цепи сопряжения и к изменению окраски.

Электронодонорные и электроноакцепторные группы, способствующие углублению и усилению окраски, называются ауксохромами.

Цвет вещества зависит такж от степени ионизации молекулы: одно и то же вещество будет окрашено по разному в полярных и неполярных растворителях.

Из внутриклеточных компонентов в видимой области спектра свет поглощают некоторые пигменты. Наиболее важные компоненты клеток, такие как белки и нуклеиновые кислоты, поглощают свет в ультрафиолетовой (УФ) области спектра.

Возможности изучения собственного излучения (первичная флуоресценция) клеточных компонентов также ограничены. Собственной видимой флуоресценцией обладают пигменты, в частности хлорофилл, катехоламины, некоторые витамины. Нуклеиновые кислоты, белки, полисахариды дают УФ-флюоресценцию.

Подавляющее большинство методов цитохимического анализа основано на использовании красителей.

Вещества, поглощающие свет в видимой области спектра, воспринимаются нами как окрашенные. Их цвет определяется длиной волны пропускаемого света и является дополнительным к цвету поглощаемых лучей, т. е. вместе они составляют ощущение белого цвета. Кроме того, цвет вещества зависит от интенсивности поглощения, которая определяет насыщенность окраски.

Существует несколько классификаций красителей построенных на разных принципах. Одна из них основана на принадлежности хромофора к тому или иному классу органических соединений, например: дифенил - и трифенилметановые красители, тиазиновые красители, ксантеновые и акридиновые красители, азокрасители и т. д. :

Аурамин- дифенилметановый краситель

Метиленовый синий – тиазиновый краситель

Родамин В – ксантеновый краситель

Акридиновый желтый – акридиновый краситель

Бисмарк коричневый - азокраситель

Основанием для другой классификации служит тип связи, возникающий при взаимодействии красителя с веществом, прежде всего ковалентной или ионной.

Красители, образующие прочные к о в а л е н т н ы е связи с окрашиваемым веществом, называют активными красителями. Молекула такого красителя, кроме хромофора, содержит активную (реакционную) группу, определяющую возможность образования ковалентной связи с функциональными группами вещества. Активная группа соединена с хромофором через мостиковую группу. Примером активного красителя может служить проционовый ярко-голубой R. В качестве мостиковых групп часто выступают NH -, SO2 -, NH-SO2 и NHSO-.

Активная группа определяет условия, при которых краситель взаимодействует с веществом. Активными группами наиболее распространенных в биологии красителей, так называемых проционов, служат производные триазина.

Красители могут содержать несколько активных групп (одинаковых или разных), что увеличивает прочность связи красителя с веществом.

Активные красители можно использовать как витальные, а затем ткань фиксировать и готовить препарат для микроскопирования. Прочность связи красителя с веществом такова, что она не разрушается при этих процедурах. Это дает возможность пометить конкретную клетку, характеристики которой изучались при жизни (допустим, измерялся потенциал), а затем исследовать ее цитохимически. Введение метки в виде активного красителя, связавшегося с определенными белками и углеводами, позволяет проследить динамику их перемещения в клетках и тканях и, таким образом, заменить радиоавтографическое мечение.

Красители, образующие и о н н ы е связи с веществом, обязаны способностью к диссоциации ауксохромной группе. В зависимости от того, является окрашенным катион или анион, выделяют основные или кислотные красители:

Эозин К - кислотный краситель

Пиронин Ж - основной краситель

Краситель может содержать одновременно электронодонорную и электроноакцепторную ауксохромные группы и, следовательно, являться амфотерным - фуксин кислый (рубин С).

В смеси кислотные и основные красители могут образовывать солеобразные соединения, и тогда говорят о нейтральных красителях. Примером может являться азур II-эозин – распространенный краситель для дифференциального окрашивания хромосом (краситель Гимза или Романовского): эозин, азур II – смесь азура I с метиленовой синью в соотношении 1:2. В свою очередь, азур I – это хлорид диметилтионина с примесью хлорида триметилтионина:

Если характеризовать красители с точки зрения ауксохромных групп, то можно выделить индифферентные красители – вообще не содержащие способной к диссоциации группы. Это жирорастворимые красители типа суданов. Они используются для выявления липидов.

В последние десятилетия в цитохимии нуклеиновых кислот широко применяют новый тип красителей – интеркалирующие красители. К ним относятся в первую очередь акридиновые красители: профлавин, акридиновый оранжевый, акрифлавин, акридиновый желтый.

Взаимодействие этих красителей с нуклеиновыми кислотами, происходит в две стадии. Вначале имеет место электростатическое связывание красителя с внешней стороной полимера за счет притяжения катионов азотосодержащего кольца к отрицательно заряженным фосфатным группам цепи нуклеиновых кислот. Затем внешняя связь диссоциирует, происходит внедрение молекулы красителя в спираль со стороны малой бороздки между соседними парами оснований (плоскость молекулы интеркалированного красителя почти перпендикулярна оси спирали и параллельна плоскостям оснований). Для молекулы акридина показано, что его N-кольцо располагается относительно водородных связей соседних пар оснований так, что возможно максимальное взаимодействие p-электронов. Дополнительная стабилизация комплекса достигается гидрофобными взаимодействиями между парами оснований и кольцами красителя.

Если поглощение света (видимого или УФ) сопровождается его излучением, то мы имеем дело с люминесценцией и соответственно с люминесцирующими, а точнее с флуоресцентными красителями. С точки зрения других классификаций флуоресцентные красители могут быть самыми различными: содержать хромофоры разной химической природы, относиться к классу активных красителей, быть кислотными или интеркалирующими и т. д.