Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 3 )

Для последующего приготовления препаратов, высушенную ткань обычно заливают в парафин. Во время пропитывания парафином возможна диффузия липидов и других неполярных соединений. При контакте с воздушной средой происходит увлажнение материала, которое влечет за собой диффузию водорастворимых веществ. Поэтому блоки и срезы стараются хранить при пониженной температуре в эксикаторах с поглотителями влаги. Недопустимо расправлять срезы в воде. Их либо монтируют на сухом подогретом стекле и затем фиксируют, либо расправляют срезы непосредственно в фиксаторе.

Метод лиофилизации состоит из многих этапов, каждый из которых требует специального контроля и может вносить свои артефакты: высушивание проводится при температурах, при которых нельзя исключить процессы рекристаллизации; сложно контролировать подогрев высушенного материала, так как термический градиент зависит от свойств и толщины образца. Недостаточное высушивание само по себе может приводить к неконтролируемым изменениям ткани.

Совершенствование метода лиофилизации привело к возникновению метода замещения в замороженном состоянии.

После замораживания образца проводят удаление воды из материала, замещая ее жидкостями, замерзающими при низких температурах. Сначала материал пропитывают жидкостью, которая растворяет кристаллы льда (обычно используют этиловый спирт). Замещение проводят при температурах около –30о...-40о С. Затем спирт замещают органическими растворителями типа толуола. После этого материал переносят в термостат, где происходит пропитка парафином.

Такая последовательность процедур, позволяет избежать недостатков метода лиофилизации, связанных с трудностью контроля за температурой высушивания и определения времени окончательного обезвоживания. Однако, при этом фиксации материала также не происходит.

Специально проведенные исследования показали, что картина фиксации определяется тем веществом, в соприкосновение с которым материал вступает первым при комнатной температуре. Например, если расправлять срезы в формалине, то картина фиксации больше будет напоминать формалиновую. Это послужило толчком для дальнейшей модификации метода замещения: после растворения кристаллов льда в спирте, спирт замещают фиксатором и затем повышают температуру до комнатной. Оказалось, что при фиксации обезвоженных тканей фиксаторы ведут себя немного не так, как при фиксации свежего материала. Спирт, например, не вызывает грубой грануляции содержимого клеток, а сохраняет их тонкую структуру. Осмиевая кислота в обезвоженную ткань проникает гораздо быстрее и на большую глубину, при этом сохраняется активность некоторых ферментов.

Уплотнение материала и приготовление срезов

Для изучения с помощью микроскопа толстые кусочки органов непригодны, т. к. они непрозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его следует резать на пластинки – срезы, толщина которых составляет сотые или даже тысячные доли миллиметра. Сделать такие срезы от руки невозможно. Существуют специальные приборы – микротомы, которые позволяют разрезать кусочек органа на тончайшие пластинки; толщину пластинок можно регулировать с помощью особых приспособлений.

Но для того чтобы резать на микротоме кусочек ткани, его надо предварительно уплотнить. Это достигается путем замораживания кусочка (его режут тогда на особом замораживающем микротоме) или путем пропитывания его застывающими жидкостями – жидким парафином, который застывает при определенной температуре, раствором целлоидина в смеси равных частей абсолютного спирта и эфира или глицерин-желатиной.

Ни целлоидин, ни парафин в воде не растворяются, и поэтому промытый после фиксации кусочек органа необходимо предварительно обезводить и лишь после этого пропитывать целлоидином или парафином.

Таким образом, приготовление микротомных срезов включает следующие манипуляции: промывку и обезвоживание кусочка ткани; заливку в парафин или целлоидин; резание кусочка ткани на микротоме

П р о м ы в к о й обеспечивается первоначальное очищение материала от самого фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей. Обычно промывают фиксированный материал в проточной воде в течение 24-48 часов или в спиртах различной концентрации. Промывку проводят в большой емкости (стеклянный сосуд), который необходимо обвязать марлей. Через отверстие в марле на дно сосуда необходимо пропустить резиновый шланг и присоединить его к водопроводному крану. Материал помещают в сосуд в марлевых мешочках.

О б е з в о ж и в а н и е

После промывки фиксированный материал нужно тщательно обезводить. Для обезвоживания служит набор (или батарея) спиртов (этиловый, реже другие спирты) повышающейся концентрации.

Большое значение для получения хороших микроскопических препаратов имеет постепенность обезвоживания. Чем нежнее препарат и чем больше опасность его сжатия или сморщивания, тем последовательнее надо повышать крепость спирта. Лучше всего приготовить ряд спиртов повышающейся концентрации (Табл.1). Время пребывания материала в спиртах различно для разных тканей, как правило, выдерживают в каждом спирте не менее 24 часов.

Чтобы получить абсолютный спирт, можно к 96º спирту добавить обезвоживающие агенты, например окись кальция (известь) или обезвоженный медный купорос.

Таблица 1

Приготовление спиртов различной концентрации

Для получения 100мл спирта	Нужно взять миллилитров
96º спирт	Дист. вода	90º спирт	Дист. вода
40º 45º 50º 60º 70º 80º 90º	42 47 52 63 73 83 94	58 53 48 37 27 17 6	44 50 56 67 78 89 -	56 50 44 33 22 11 -

З а л и в к а м а т е р и а л а в п а р а ф и н

Для того чтобы приготовить срезы, необходимо обезвоженные кусочки материала залить в застывающую среду для уплотнения и затем резать их на микротоме. При заливке в парафин в качестве промежуточных сред между спиртом и парафином, кроме ксилола, могут быть использованы хлороформ и бензол.

Преимущество заливки в парафин заключается в относительной быстроте, возможности получения весьма тонких срезов (до 3 и 5 мкм) в виде серий, что особенно важно для гистологических работ.

Из недостатков парафиновой заливки нужно отметить действие высокой температуры (56-58ºС), что небезразлично для строения ткани (сжатие материала на 8-20%), и необходимость в дополнительной процедуре удаления парафина перед окраской.

Для заливки кусочков ткани употребляют белый или перегретый продолжительным кипячением желтый парафин, имеющий точку плавления не выше 52-54ºС. Для большей пластичности парафина хорошо прибавить к нему до 5% пчелиного воска.

Приготовление парафина. В большую емкость наливают более 2/3 воды, помещают парафин (на один палец) и кипятят неделю, выключая на ночь. Ежедневно утром достают охлажденный парафин и соскабливают нижний слой на 2 мм до появления блеска. На 5 день к парафину добавляют пчелиный воск (1-2% на весь парафин) и кипятят еще 2 дня, соскабливая нижний слой. Затем помещают парафин в фарфоровом стакане в термостат при 56-58ºС, и расплавленный парафин фильтруют через фильтровальную бумагу в термостате.

Для окончательной заливки необходимо иметь в термостате расплавленный в колбе парафин. Заливку материала производят либо в специальных металлических формочках, либо в формочки, изготовленные из бумаги. Материал располагают на дне формочки и осторожно заливают жидким парафином, а затем формочку переносят в холодную воду, пока не застынет парафин. Чем быстрее наступило охлаждение и затвердение парафина, тем лучше происходит резание парафиновых блоков.

Из затвердевшего парафина вырезают прямоугольные блоки с залитыми кусочками, вокруг которых остается слой парафина шириной 1-2 мм. Такой блок прикрепляют к деревянному кубику, предварительно налив на последний немного расплавленного на шпателе парафина и проводя горячим шпателем по нижней поверхности блока, чтобы блок прочно прикрепился к кубику.

Микротомы – приборы для приготовления срезов тканей нужной толщины. Они бывают разной конструкции и назначения: ротационные, санные, замораживающие. Наиболее распространенные - санные микротомы устроены таким образом, что столик с объектом поднимается на определенную высоту (соответствующую толщине среза), а движущийся в горизонтальной плоскости нож режет блок. Таким образом, в санных микротомах нож и объект подвижны.

Микротом санный с автоматической подачей (Рис.1) состоит из следующих частей: станины (1), суппорта с ножедержателем (ножевые салазки с ножом) (2), механизма микроподачи (3) [механизм микроподачи имеет микровинт (4), который связан с механизмом подъема столика разъемочной гайкой], механизма подъема столика (объектные салазки с объктодержателем) (5).

2

 

6

1 5 3 4 7 8

Рис. 1. Санный микротом с автоматичской подачей

На лицевой стороне станины имеются 2 наклонные направляющие (6) для перемещения подъемника столика, а в правой части этих направляющих закреплен кронштейн автоматической микроподачи, который смонтирован под станиной. На кронштейне установлен лимб (7) с делением для контроля микроподачи и с рукояткой для подачи объекта вручную. Установленную величину микроподачи можно определить по шкале (8), каждое деление которой равно 1 мкм (Рис.1).