Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 8 )

Появляются методы, позволяющие сортировать клетки перед их гомогенизацией. Так, с помощью противоточного распределения можно разделить ретикулоциты и эритроциты, поскольку они отличаются некоторыми характеристиками поверхностных мембран. В градиенте фиколл-пака удается разделить популяции тимоцитов.

Особую ценность приобретают методы сортировки клеток, основанные на использовании проточного сортировочного цитоспектрофотометра. Отличающиеся по своим параметрам клетки (величина клеток, ядер, содержание ДНК, наличие определенных поверхностных мембранных антигенов и пр.) можно выделять в достаточном для биохимического анализа количестве (скорость сортировки может достигать 5 тыс. клеток в секунду).

Ультрамикрохимические методы

Принципиальный недостаток биохимических методов, связанный с усреднением результатов, снимается при переходе на ультрамикромасштаб, т. е. при анализе единичных клеток или небольшого их числа. Однако развитие ультрамикрохимичеких методов было вызвано не этим соображением, а жизненной необходимостью, возникшей при изучении материала, который невозможно получить в достаточном для биохимического анализа количестве. Например, ткани человека, часто доступные только как биопсийный материал.

Есть еще одна важная область биологии, где анализируемый материал представлен отдельными клетками, и где не обойтись без применения ультрамикрохимических методов - это биология развития.

Сложности работы в ультрамикромасштабе начинаются уже на этапе получения материала. В зависимости от задач исследования, используют свежую или фиксированную ткань.

Для изучения нуклеиновых кислот можно использовать предварительно фиксированный, обезвоженный и залитый в парафин материал. Отдельные клетки вырезают из толстых парафиновых срезов.

При определении интенсивности анаэробного гликолиза или дыхательных процессов анализируемый материал должен подвергаться как можно меньшему количеству манипуляций. Отдельные клетки выделяют непосредственно из тонких срезов свежей ткани.

Изучение НАД - и НАДФ-зависимых дегидрогеназ и трансаминаз можно проводить в клетках, выделенных из лиофилизированных срезов, полученных в свою очередь, в криостате при –20оС из замороженной ткани. Для выделения примняют специальные иглы или ножи: стальные, вольфрамовые, стеклянные. Выделение проводят под контролем широкоугольного микроскопа, при необходимости используют микроманипуляторы.

После выделения клеток следует этап фракционирования клеточного содержимого с последующей идентификацией фракций. Обычно это микро - или нанограммы вещества. При манипулировании такими количествами веществами приходится работать либо с минимальными объемами достаточно концентрированных растворов или с привычными миллилитровыми количествами сильно разбавленных растворов. Последний вариант, как правило, не приемлем: чувствительность существующих приборов не расчитана на малые концентрации вещества в растворах. Используется первый вариант.

При этом следует учитывать, что резко возрастает отношение поверхности к объему. Поверхностные явления приобретают огромное значение - может произойти полное «растекание» анализируемой жидкости по поверхности пробирки или пипетки. Вот почему посуда, используемая для анализа, изготавливается из тефлона или гидрофобизированного стекла.

При небольших объемах увеличивается роль диффузных явлений, которые, с одной стороны, очень сильно мешают разделению веществ, с другой – облегчают процедуру перемешивания растворов, а в объемах меньше 1 мкл даже полностью ее заменяют.

Необходимо учитывать высокую скорость испарения. Быстрое испарение облегчает концентрирование вещества, и его можно проводить при пониженных температурах. В то же время испарение усложняет работу: приходится проводить процедуры в специальных влажных камерах, под слоем гидрофобной жидкости.

Активное развитие ультрамикрохимических методов пришлось на 60-е годы прошлого века. С помощью этих методов были изучены изменения количества и нуклеотидного состава РНК, активность ряда фрментов в ходе оогнеза и раннего эмбриогенеза. Получены интересные данные об активности ферментов при дифференцировке различных клеток.

Дальнейшее развитие методов работы с отдельными клетками требует как усовершенствования оборудования (в частности, необходимого для идентификации клеточных компонентов и определения их количества), так и создания принципиально новых подходов. Один из таких подходов был использован в конце 50-х - начале 60-х годов 20 века для измерения активности дегидрогеназ, связанных с никотинамидадениндинуклеотидом (НАД+) или с никотинамидадениндинуклеотидфосфатом (НАДФ+). Он основан на возможности определения количества пиридиннуклеотидов по их флуоресценции при облучении ультрафиолетовым светом с длиной волны 470 нм.

Суть процедуры в следующем: после проведения реакции

Фермент

Субстрат " Продукт реакции

НАД+ M НАД. Н

Избыток НАД+ разлагают разбавленной щелочью, а количество НАД. Н, пропорциональное активности анализируемого фермента, измеряют флуорометрически после соответствующих обработок для образования интенсивно флуоресцирующего продукта. Этим методом может быть определено содержание пиридиннуклеотида в крупной нервной клетке (около 10-12 М).

Для увеличения разрешающей способности метода предложена его модификация, которая получила название метода «циклирования».

Метод «циклирования»

После проведения первой реакции, во время которой образовался НАДФ. Н, избыток НАДФ+ разрушают нагреванием до 60оС, затем добавляют «циклирующий агент», содержащий глюкозо-6-фосфат, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, a-кетоглутарат, NH3 и глутаматдегидрогеназу. В присутствии НАД. Н реакции восстановительного аминирования a-кетоглутарата и окисления глюкозо-6-фосфата следуют друг за другом в виде цикла:

глутаматдегидрогеназа

a-кетоглутарат + NH3 " глутамат + СО2

L

НАДФ. Н НАДФ+

M

глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

6-фосфоглюконат ! глюкозо-6-

- фосфат

Используемые концентрации пиридиннуклеотидов значительно ниже констант Михаэлиса, и, следовательно, скорости реакций пропорциональны концентрациям НАДФ+ и НАДФ. Н.

Инкубацию продолжают около 30 минут, затем реакционную смесь нагревают до 100оС. Реакции останавливаются, и пиридиннуклеотиды разрушаются. Остается измерить содержание образовавшегося 6-фосфоглюконата. Для этого проводят следующую реакцию:

6-фосфоглюконатдегидрогеназа

6-фосфоглюконат " рибулозо -

-5-фосфат + СО2

НАДФ+ M НАДФ. Н

Избыток НАДФ+ разрушают нагреванием до 60оС, а образовавшееся количество НАДФ. Н, эквивалентное содержанию 6-фосфоглюконата, измеряют флуорометрически.

«Циклирование» не увеличивает ошибку метода. Применение метода «циклирования» позволяет измерять концентрацию пиридиннуклеотидов порядка 10-14 - 10-19 М.

Вопросы для самоконтроля

1. Перечислите основные этапы биохимического анализа клеток.

2. В чем суть процесса гомогенизации?

3. Какие требования предъявляют к гомогенату?

4. Какие способы гомогенизации вам известны?

5. Какой способ гомогенизации предпочтительнее при выделении

плазматических мембран эритроцитов млекопитающих?

6. Растворы каких веществ чаще всего используются в качестве

водной среды для гомогенизации клеток?

7. Что служит основой безводной среды для гомогенизации и

фракционирования клеток?

8. Какая концентрация сахарозы используется чаще всего в

качестве водной среды при гомогенизации клеток?

9. Как осуществляют фракционирование содержимого клеток и

тканей?

10. Что необходимо добавить в водную среду для гомогенизации,

чтобы выделить плазматические мембраны в виде «листочков»,

а не в виде «пузырьков», т. к. содержимое последних будет

загрезнять фракцию при дальнейшем анализе материала?

11. Какие вещества необходимо предварительно ввести животным,

чтобы при фракционировании плотность лизосом была выше

плотности других органелл?

12. Какое необходимо выбрать ускорение центрифуги для

выделения митохондрий?

13. Как провести морфологический и биохимический контроль

фракций?

14. Когда фракция считается «чистой»?

15. Какое соединение является маркером митохондриальной

фракции?

16. Основные недостатки биохимических методов исследования.

17. Когда и почему используют ультрамикрохимический анализ?

18. Ультрамикрохимическое определение активности дегидрогеназ,

связанных с НАД+ и НАДФ+.

19. Метод «циклирования» в ультрахимии.

20. Какой состав «циклирующего агента» используется для

определения активности дегидрогеназ, связанных с НАД+ и

НАДФ+, в методе «циклирования»?

Раздел 3. РАДИОАВТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Радиоавтографические методы – это методы, позволяющие избирательно пометить вещество еще при жизни организма, а затем, используя разные сроки взятия материала, проследить пути перемещения данного вещества в клетках и тканях, т. е. изучить клеточные процессы в динамике. Метод радиоавтографии впервые разработали Беланже (Belanger) и Леблон (Leblond) в 1946 г.

Радиоавтографические методы состоят из трех этапов:

1.  Включение изотопа

2.  Распад изотопа с образованием ионизирующих частиц

3.  Фоторегистрация ионизирующих частиц.

Включение изотопа

Изотоп вводится в организм обычно в составе вещества - предшественника изучаемого синтеза. При выборе предшественника необходимо учитывать ряд требований:

1. Иметь по возможности полное представление о метаболическом пути вещества, выбранного в качестве предшественника. Вещество должено хорошо проникать в клетку. Оптимальным было бы его участие только в одной метаболической цепи. Синтезированное соединние должно быть стойким, чтобы исключить повторное включение меченого вещества. Следует хорошо знать сроки и пути выведения невключившегося предшественника из организма. При этом обязательно надо учитывать положение изотопа в молекуле предшественника, так как изотоп, находящийся в разных положениях, может иметь различную судьбу.