Цитогистохимия Учебно-методическое пособие (стр. 2 )

Для предотвращения посмертных изменений необходимо, чтобы время между взятием материала и его фиксацией было минимальным. Самые ранние посмертные изменения выявляются электронно-микроскопически и касаются изменений структуры различных органелл. Например, в ядре уже через 5 минут наблюдается агрегация хроматина, которая усиливается и через 15 минут приводит к его значительному перераспределению. Особенно важно быстро фиксировать ткани при количественных исследованиях. Наркоз применим не всегда (недопустимо применение эфира или хлороформа при изучении ферментов лизосом). Фиксация должна происходить быстро и по возможности захватывать одновременно все клетки фиксируемой ткани. Для этого фиксируют мелкие кусочки ткани, помещая их не на дно сосуда, а на рыхлые прокладки или используют специальные держатели.

Для ускорения химической фиксации пользуются горячими фиксаторами. Однако при высокой температуре ускоряются и посмертные изменения. Гораздо лучшие результаты получаются при температуре фиксатора 0…+4оС, так как при этом процессы автолиза резко замедляются.

Химические способы фиксации.

Простые фиксаторы – это различные обезвоживающие вещества – этиловый и метиловый спирты; ацетон; соли тяжелых металлов (сулема, хлорид платины); кислоты (уксусная, трихлоруксусная, пикриновая, осмиевая); растворы формальдегида и других альдегидов.

Спирт денатурирует белки и осаждает нуклеиновые кислоты. Липиды сохраняют свою растворимость и экстрагируются из клеток в процессе самой фиксации или при последующих процедурах. Гликоген осаждается, но сохраняет свою растворимость в воде. Спирт вызывает сморщивание тканей и их затвердевание.

Уксусная кислота быстро проникает в ткани, сохраняет неизменной структуру ядра и хромосом, растворяет липиды, вызывает набухание тканей и их размягчение.

Альдегиды реагируют в первую очередь с белками, с группами, содержащими активный атом водорода. Фиксация нуклеиновых кислот достигается взаимодействием с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями и с белковыми компонентами хроматина. Углеводы альдегидами не фиксируются, но они могут удерживаться фиксированными белками. Фиксация липидов возможна при длительном воздействии и осуществляется через этиленовую группу. Альдегидная фиксация уменьшает растворимость липидов в органических растворителях. Чем разветвленнее молекула альдегида, тем выше его фиксирующая способность. При альдегидной фиксации ткани практически не сокращаются.

Осьмиевая кислота реагирует в основном с ненасыщенными липидами с образованием моноэфиров. Белки фиксируются непосредственно (за счет взаимодействия осмиевой кислоты с триптофаном, гистидином и цистеином) и, кроме того, в составе мембран удерживаются прочно связанными липидами, что приводит к резкому уменьшению и даже полному исчезновению их ферментативной активности. Осмиевая кислота проникает в ткани медленно и на небольшую глубину, а также препятствует пропитыванию парафином и затрудняет окраску препаратов.

Ацетон используется для фиксации при срочных исследованиях, когда не может быть использован замораживающий микротом. Ацетон сильно сморщивает ткани.

Хотя у некоторых фиксаторов есть отдельные достоинства, но ни один из них не безупречен. Отсюда естественная тенденция составлять смеси этих химикатов с тем, чтобы получить фиксатор, сочетающий в себе преимущества каждого компонента и свободный от недостатков, присущих каждому из них.

Сложные фиксаторы – смеси, состоящие из нескольких фиксирующих веществ. Существует сотни различных рецептов фиксаторов для разных целей, различных тканей, организмов (Пирс, 1962). Один из самых распространенных – смесь формалин - уксуная кислота - спирт (ФУС). Логические размышления, лежащие в основе составления смеси ФУС, сводятся к следующему: формалин и спирт фиксируют белки, уксусная кислота - нуклеиновые кислоты. Спирт приводит к резкой дегидратации и сморщиванию тканей; уксусная кислота, напротив, вызывает их набухание, препятствует затвердеванию фиксированного материала, которое возникает при действии формалина и спирта. В качестве примера можно привести две прописи смеси ФУС, в которых относительные количества составляющих реактивов резко различаются:

Составляющие растворы Смесь 1 Смесь2

40%-й формалин 1 часть 3 части

Ледяная уксусная кислота 1 часть 3 части

50%-й этиловый спирт 18 частей 1 часть

Соотношения компонентов подбираются эмпирически для тканей разного происхождения так, чтобы недостатки фиксации были минимальными. Если какой-то из недостатков все-таки имеется, например сморщивание ткани, то соотношение компонентов меняется, в данном случае в пользу уксусной кислоты.

Выбор фиксатора определяется конкретными задачами каждого исследования. Так, при анализе нуклеиновых кислот используют спирт - уксусные смеси, для белков - преимущественно альдегидные.

Жидкость Буэна – фиксатор, который рекомендуется для исследований соединительной и мышечной тканей, для приготовления обзорных препаратов. Смесь состоит из 1 части ледяной уксусной кислоты, 5 частей формалина и 15 частей пикриновой кислоты.

Жидкость Карнуа – фиксатор, состоящий из 63 мл абсолютного спирта, 10 мл ледяной уксусной кислоты и 30 мл хлороформа, используется при исследовании ядер, нуклеиновых кислот.

Жидкость Шаффера – фиксатор, состоящий из 2 частей абсолютного спирта и 1 части формалина, является универсальным фиксатором, используется для выявления белков.

Жидкость Чаччо - составляют смешиванием 80 мл 5% раствора бихромата калия, 20 мл формалина и 5 мл ледяной уксусной кислоты. Применяют для фиксации липидов.

Фиксатор Лилли состоит из 8 г нитрата свинца, 10 мл формалина, 10 мл воды и 80 мл этилового спирта. Используют при выявлении мукополисахаридов, мукопротеидов.

При выборе фиксатора необходимо учитывать, каким воздействиям в дальнейшем будет подвергаться анализируемый материал. Например, если анализироваться будут срезы, то нужно помнить, что заливка в парафин или целлоидин требует применения большого количества органических растворителей для обезвоживания материала, при этом будет вымываться из клеток все, что было плохо зафиксированно. Следует помнить и о том, что в водных растворах (большинство красителей, инкубационные растворы) также происходят потеря и перераспределение, но уже водорастворимых веществ.

Не всегда удается подобрать оптимальный химический фиксатор. Так, химическая фиксация практически неприемлема при изучении активности клеточных ферментов. В этом случае используют физические способы фиксации, основанные на замораживании материала. Затем можно готовить срезы в криостате непосредственно из замороженных кусочков ткани, а можно подвергать их лиофилизации или замещению в замороженном состоянии.

Физические способы фиксации

Цель замораживания - перевести воду в кристаллическое состояние. Образующиеся кристаллы льда должны быть меньше разрешающей способности микроскопа, для того чтобы не нарушались морфологические структуры клетки. Кристаллы льда тем мельче, чем больше центров кристаллизации. Скорость их возникновения резко увеличивается при низких (ниже –100оС) температурах. Чем быстрее достигается низкая температура, т. е. чем быстрее охлаждается материал, тем больше количество образующихся кристаллов и тем они мельче. Высокая скорость замораживания уменьшает токсическое действие концентрированных солевых клеточных растворов, которые возникают при переходе воды в кристаллическое состояние.

Таким образом, главным условием успешного замораживания является быстрота охлаждения ткани (более 1 000оС). Для этого необходимо подвергать замораживанию очень небольшие кусочки ткани (не толще 1-2 мм), однако следует учитывать, что даже при таких размерах замораживание не будет одинаковым по всему объему кусочка. Лучшие результаты будут во внешнем слое.

Важен характер охлаждающей жидкости. Обычно используют какое-либо органическое вещество с низкой температурой замерзания и высокой теплоемкостью, которое охлаждают жидким азотом. Это может быть изопентан (температура замерзания - 165оС), изопентан-бутан (-190о С), пропан (- 185о С).

Замораживание непосредственно в жидком азоте (-195оС) не применяется. Так как при этом вокруг охлаждаемого кусочка ткани возникает оболочка из газообразного азота, обладающего низкой теплопроводностью. Поэтому охлаждение материала идет медленнее (400о/с, по сравнению с 4 000о/с при замораживании, в охлажденном жидким азотом, пропане).

Мелкокристаллический лед, возникающий при быстром замораживании, является неустойчивым образованием. При повышении температуры происходит рекристаллизация с образованием более крупных кристаллов, которые могут нарушить целостность внутриклеточных структур. Повышение температуры обязательно происходит при последующих процедурах приготовления препаратов. Выделение тепла наблюдается при ударе микротомного ножа о блок. Монтировка среза и его дальнейшая обработка часто проводятся при температурах около 0о С и выше.

Все эти моменты учитывают и подбирают конкретно для каждого образца условия, при которых повреждения клеток минимальны и не выявляются при микроскопии.

Оптимальным было бы избежать повреждающего действия рекристаллизации, путем быстрого нагревания образца сравнимого со скоростью замораживания. Однако, на практике это не достижимо. Остается один путь - избавиться от наличия воды в замороженном материале. Для этого существует два способа: лиофилизация и метод замещения в замороженном состоянии.

Лиофилизация (лиофильная сушка) достигается возгонкой льда при низких температурах (обычно около –30о... –40о С) в вакууме. Для того, чтобы сушка проходила с достаточной скоростью, необходима дополнительная энергия, которая поступает к образцу за счет теплопроводности или обеспечивается излучением. Широко применяется высушивание при пониженном давлении в токе сухого газа.

Выбор условий лиофилизации зависит от типа ткани и осуществляется эмпирически. Температура, при которой ведется высушивание, определяется температурой замерзания тканевой жидкости и зависит от концентрации солей в данном типе клеток. Богатые неорганическими солями ткани подлежат высушиванию при более низких температурах (-55оС). Время полного высушивания образца зависит от его размера и тканевой принадлежности. В среднем оно составляет около суток, но может быть и значительно больше.