Разработка и стандартизация противовоспалительного лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта (стр. 1 )

На правах рукописи

Доброхотов Денис Анатольевич

Разработка и стандартизация противовоспалительного лекарственного сбора для лечения и профилактики заболеваний пародонта.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

14.04.02 – Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Москва 2011

Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный медицинский университет имени

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук,

профессор

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук,

профессор

Доктор фармацевтических наук,

профессор

Ведущая организация

ФБГУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения"

Защита состоится "___"___________ 2011 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Первый МГМУ им. г. Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан "___"____________________2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук,

профессор Наталья Петровна Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В настоящее время ассортимент лекарственных средств растительного происхождения, применяемых в практическом здравоохранении, составляет более 40%. Одним из путей увеличения количества препаратов растительного происхождения является широкое изучение действия уже известных фармакопейных лекарственных растений, часто используемых по ограниченному числу показаний, а также составление рациональных многокомпонентных растительных композиций (сборов), которые являются наиболее популярными, доступными для населения и содержат биологически активные вещества с разносторонним фармакологическим действием для коррекции многих связанных между собою биохимических процессов организма. Перспективность и развития исследований в области разработки новых прописей многокомпонентных сборов для лечения разнообразных патологий обеспечивается достаточной сырьевой базой по большинству видов лекарственных растений. Вместе с тем ассортимент сборов, получивших разрешение к медицинскому применению в Российской Федерации, не велик (порядка 40 наименований). Следует отметить, что в стоматологической практике сборы на основе лекарственного растительного сырья не находят, на сегодняшний день, достойного применения. Расширение исследований по изысканию источников для получения новых эффективных и безопасных лекарственных растительных средств, обеспечивающих комплексное фармакологическое воздействие на все звенья патогенеза в стоматологической практике, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования. Теоретическое и экспериментальное обоснование разработки и стандартизации сбора для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1.  Разработать методологический подход к созданию многокомпонентных растительных сборов для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта; с учетом патогенеза заболеваний пародонта теоретически и экспериментально обосновать выбор оптимального состава сбора;

2.  Изучить ассортимент лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырья, спрос, потребности и обосновать необходимость создания лекарственного растительного средства, применяемого для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта;

3.  Изучить химический состав сбора для профилактики лечения заболеваний пародонта, а также провести оценку его антимикробного действия;

4.  Провести комплексные фармакогностические исследования многокомпонентного растительного сбора, определить критерии подлинности и показатели качества сбора, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания.

5.  Провести поиск веществ-маркеров, позволяющих идентифицировать все заявленные компоненты в анализируемом сырье.

6.  Изучить влияние основных факторов экстракции на выход биологически активных веществ из сборов.

7.  Разработать нормативную документацию на предлагаемый сбор: проект фармакопейной статьи на сбор.

8.  На основе предложенного сбора разработать удобную форму –фильтр-пакет.

Научная новизна работы. Сформулирован подход формирования состава сбора для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта с учетом многофакторного воздействия каждого компонента.

В ходе исследования специализированной литературы и патентной документации, обоснован состав нового отечественного сбора для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, с оригинальным набором компонентов, позволяющий осуществлять фармакологическое воздействие на многофакторные звенья развития патологического процесса в тканях пародонта.

Новизна проведенных исследований подтверждена патентом № 000 "Лекарственный сбор для лечения и профилактики заболеваний пародонта, осложненного аллергическим состоянием" от 01.01.01 года.

Выявлены вещества-маркеры, позволяющие доказать заявленные компоненты в сборе, и с учетом проведенных исследований предложены методы идентификации всех заявленных компонентов в анализируемом сборе.

В ходе фармакогностических исследований определены морфологические признаки растительных компонентов сбора, выявлены диагностически значимые признаки лекарственного растительного сырья в сборе. С использованием комплекса методов (тонкослойная и высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия) в анализируемом сборе установлено содержание основных групп биологически активных веществ флавоноидной природы, фенолкарбоновых кислот, сапонинов, полисахаридов, эфирных масел, органических кислот, аминокислот.

С учетом значимости отдельных групп биологически активных веществ в обеспечении лечебных эффектов разработаны методики их количественной оценки и предложены показатели качества, необходимые для стандартизации. На основании проведенных исследований обоснована необходимость комплексного подхода к стандартизации сбора, включающей идентификацию всех заявленных компонентов.

С целью определения доброкачественности сбора, предложены методики количественного определения - содержания суммы флавоноидов, дубильных веществ, полисахаридов, глицерризиновой кислоты, включенные в проект нормативной документации на анализируемый сбор.

Изучено влияние размера частиц и условий экстракции на выход биологически активных веществ, на основании чего сформулированы рекомендации по оптимальному режиму настаивания. Осуществлено определения ряда маркерных веществ, обеспечивающих надежную идентификацию компонентов сбора при стандартизации.

С учетом разработанных методов анализа определены оптимальные сроки хранения созданного лекарственного сбора.

Практическая значимость результатов исследования. Полученные экспериментальные данные позволяют рекомендовать новый растительный сбор в качестве эффективного средства для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта, что расширяет арсенал отечественных средств растительного происхождения, применяемых в стоматологической практике.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС на сбор для лечения и профилактики заболеваний пародонта. Результаты исследований по выявлению веществ-маркеров в ЛРС, входящем в состав сбора, внедрены в обучающий модуль «Особенности сквозной стандартизации лекарственного растительного сырья» в спец. курсе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии Российского Университета Дружбы Народов, а также использованы в проекте методического руководства по контролю качества сборов из лекарственного растительного сырья, используемых в качестве средств для лечения и профилактики стоматологических заболеваний в лаборатории контроля качества медицинской техники и оборудования Главного управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в Республике Узбекистан.

Связь задач исследований с проблемным планом научного совета по фармакологии и фармации. Диссертационная работа осуществлялась в соответствии с планом научно-исследовательской работы кафедры общей химии Первого МГМУ им. по теме: "Оценка качества и сертификация лекарственных препаратов лекарственного растительного сырья и продуктов его переработки" (Номер государственной регистрации ).

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на XVI Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 2009); XVII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва 2010); научно-практической конференции "Актуальные вопросы образования, науки и производства в фармации" (Ташкент 2009); научно-практической конференции "Интеграция образования, науки и производства в фармации" (Ташкент 2010); IV Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов" (Москва 2007); Учебно-методической конференции сотрудников Академии, посвященной 250-летию ММА им. (Москва 2007); Учебно-методической конференции сотрудников Академии, посвященной 250-летию ММА им. (Москва 2008); Научно-практической конференции, посвященной 5-ти летию студенческого научного общества стоматологического факультета (Москва 2009); Научно-практической конференции, посвященной 105-летию со дня рождения доктора фармацевтических наук, профессора Ивана Алексеевича Муравьева (Пятигорск 2009); Республиканской научно-практической конференции "Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья" (Ташкент 2006); Межкафедральной конференции кафедр общей химии и ботаники ГОУ ВПО Первый МГМУ им. .

Личный вклад автора. Автору принадлежит роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведен мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрение в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 – "Фармацевтическая химия, фармакогнозия". Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 4, 6 и 7 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, и 1 патент РФ на изобретения.

Основные положения, выносимые на защиту:

- анализ литературных и экспериментальных исследований по обоснованию необходимости разработки состава сбора, рекомендуемого для профилактики и лечения заболеваний пародонта.

- результаты исследования химического состава в изучаемых объектах основных групп биологически активных веществ методами спектрофотометрии, ТСХ и ВЭЖХ.

- результаты анализов по установлению характеристик подлинности и определению показателей качества разработанного сбора.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 184 стр. машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания материалов и методов исследования (главы 2,3) собственных исследований (главы 4,5,6), заключения, выводов, списка литературы, который включает в себя 243 источника, из них 22 на иностранных языках, и приложений. Работа иллюстрирована 57 таблицами и 27 рисунками.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе, на основании анализа отечественной и зарубежной литературы, изучены основные тенденции развития воспалительных заболеваний пародонта, а также современных препаратов, используемых для лечения и профилактики указанных патологий. Дана краткая характеристика российского рынка лекарственных препаратов растительного происхождения, используемых для воздействия на различные звенья патологической цепи, обуславливающей развитие воспалительное заболевание пародонта. Обсуждены возможности применения фитокомпозиции с лечебной и профилактической целью при указанных заболеваниях. Рассмотрены вопросы, связанные с особенностями стандартизации многокомпонентных лекарственных растительных средств, в первую очередь касающиеся поиска специфических веществ, позволяющих идентифицировать все заявленные компоненты в многокомпонентной композиции.

Во второй главе приведены сведения об объектах исследования, а также данные методического характера.

Третья глава посвящается разработке теоретических и методических подходов к созданию многокомпонентного сбора, обеспечивающего комплексное фармакологическое воздействие при воспалительных заболевания пародонта, а также изучение ассортимента лекарственных средств на основе лекарственного растительного сырь, спроса и потребностей и обосновывается необходимость создания лекарственного растительного средства, применяемого для профилактики и комплексного лечения заболеваний пародонта.

Глава четвертая посвящена фармакогностическим исследованиям и стандартизации разработанного растительного сбора. В ней отражены данные по оценке его качества и изучению химического состава, позволившие в дальнейшем осуществлять стандартизацию разработанного многокомпонентного лекарственного растительного сбора. Подобраны оптимальные условия экстракции биологически активных веществ из сбора и даны практические рекомендации по использованию с целью лечения и профилактики заболевания пародонта.

В пятой главе приведенные данные по изучению комплекса биологически активных веществ терпеноидной природы и фенолкарбоновых кислот, на основании которых выявлены специфические для каждого вида вещества, которые могут быть использованы в качестве веществ – маркеров, обеспечивающих надежную идентификацию всех заявленных компонентов в составе анализируемого сбора.

В шестой главе приведены результаты исследований выделения БАВ из фильтр-пакетов и обосновывается возможность их использования в комплексной терапии заболеваний пародонта.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. Объектом исследования служило лекарственное растительного сырье различных морфологических групп, отвечающее требованиям нормативной документации: Radix Glycyrrhizae ( ГФ X, ст.573), Flores Calendulae officinalis (ГФ XI, ст. 5), Rhizomata Tormentillae (ФСП 42-), Herba Bidentis tripartitae (ГФ XI, ст. 45), Herba Achilleaea Millefolii (ГФ XI, ст. 53), Herba Origani vulgaris (ГФ XI), Rhizomata et radices Sanguisorbae (ФС ).

На основе указанного сырья создан сбор, обладающий выраженным антимикробным действием в отношении большинства возбудителей, который может быть рекомендован для профилактики и лечения воспалительного заболевания пародонта.

Все анализируемое сырье приобреталось на .

Отбор проб проводился в соответствии ГФ XI издания, вып. 1, стр 273.

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Изучение внешних признаков растительных смесей проводили в соответствии с указаниями статьи «Сборы» (ГФ XI изд., вып.1, стр.266.).

Микроскопическое исследование сборов осуществляли согласно методике, описанной в ГФ ХI изд., вып.1, стр. 277. («Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья»).

Идентификацию биологически активных веществ (флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ, тритерпеновых сапонинов и др.) проводили с помощью качественных реакций и методами бумажной хроматографии на бумаге Санкт-Петербургской фабрики № 2 марки «С» «Filtrak №11» и с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) «Silufol UV-254», «Kieselgel», «Merck» в системах стандартных, обычно применяемых для анализа биологически активных веществ указанных групп.

ВЭЖХ анализ фенольных соединений, глицирризиновой и органических кислот проводился на хроматографе фирмы GILSON, Франция, инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мульти Хром для Windows версия 1,47а (, Москва, Россия). В качестве неподвижной фазы использовали колонки PLATINUM EPS 100A размером 4,6х250 мм, ALTECH OA-1000 Organic Acids размером 6,5х300 мм.

Поиск специфических веществ маркеров осуществляли на газовом хроматографе Agilent Technologies 6850 Series II. Детектор масс-селективный Agilent Technologies 5973 Network. Колонка HP-5MS (30m х 0,25mm). Условия хроматографирования: температура колонки: начальный изотермический участок 35°С – 5 мин, 35-100°С, со скоростью подъема температуры 2°С/мин, 100-200°С, со скоростью подъема температуры 5°С/мин, 200-250°С, со скоростью подъема температуры 10°С/мин и конечным изотермическим участком 15 мин. Температура испари°С. Температура инжектора 30°С. Скорость газа-носителя (гелия) – 1 мл/мин.

Содержание свободных и связанных аминокислот определяли методом ВЭЖХ на приборе «KLA-3B» «Хитачи». Условия анализа стандартные, обычно применяемые для анализа белковых гидрализатов, с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Качество сбора контролировали по следующим числовым показателям: влажность (по методике ГФ XI, вып. 1, стр 285), зола общая (по методике ГФ XI, вып. 2 стр. 24), зола, не растворимая в 10% растворе соляной кислоты (по методике ГФ XI, вып. 2 стр 25), примеси, количество измельченных частиц (по методике ГФ XI, вып. 1, стр. 275-276).

Изучение антимикробной активности сбора проводилось в службе контроля качества -фарма».

Статистическая обработка экспериментальных результатов исследований нами проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI, вып.1 стр. 199-221, с использованием критерия Стьюдента.

Разработка подходов к составлению рецептур сбора для профилактики и лечения заболеваний пародонта.

Обоснование состава многокомпонентного растительного сбора

На основании анализа современной патентной документации, а также литературных данных о химическом составе и фармакологической активности отдельных видов лекарственного растительного сырья составлен сбор из лекарственного растительного сырья, рекомендуемый для профилактики и лечения заболеваний пародонта, обладающий выраженным антимикробным, противовоспалительным, эпителизирующим и имунномодулирующим действием. В его состав включены: корни солодки Radix Glycyrrhizae (20%), цветки календулы Flores Calendulae officinalis (10%), корневища лапчатки Rhizomata Tormentillae (10%), трава череды Herba Bidentis tripartitae (10%), трава тысячелистника Herba Achilleaea Millefolii (10%), трава душицы Herba origani vulgaris (20%), корневища и корни кровохлебки Rhizomata et radices sanguisorbae (20%). Заявленные компоненты измельчались до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм.

Поскольку определяющим фактором в развитии воспалительных заболеваний пародонта большинство авторов считают микробную контаминацию поверхности эмали и слизистой, нами было проведено изучение антимикробной активности водного извлечения из полученного сбора. Она определялась в разведениях (1:10, 1:100, 1:1000) суспензированных образцов в стерильном физиологическом растворе с рН=7.

В эксперименте использовали следующие системы тест-культур:

Bacillus cereus AТСС 10702

Candida abicans АТСС 885-653

Esherichia coli АТСС 25922

Staphylococcus aureus АТСС 6538-Р

Pseudomоnas aeruginosa АТСС 9027

Результаты анализа представлены в таблице 1

Таблица 1

Результаты определения антимикробной активности извлечения из сбора.

Анализируемый объект	Bacillus cereus	Candida abicans	Esherichia coli	Staphylococcus aureus	Pseudomоnas aeruginosa
Разведение 1:10	+++	+++	+++	+++	++-
1:100	+++	+++	+++	+++	++-
1:1000	++-	++-	++-	+++	+--

+++ сильно выраженное угнетение роста штамма

++- заметное угнетение тест-штамма по сравнению с контрольным высевом

+-- незначительное угнетение роста, слабый бактериостатический эффект

Приведенные данные свидетельствуют о наличии выраженного антимикробного действия анализируемого сбора, сохраняющего свою антимикробную активность даже при разведении 1:1000 в отношении большинства тест-культур, традиционно используемых для выявления бактериостатического эффекта. Следует особо отметить угнетение роста штаммов Candida abicans, Staphylococcus aureus, Pseudomоnas aeruginosa, которые оказывают заметное влияние на развитие воспаления тканей пародонта.

Обобщенные данные по подбору компонентов сбора, обладающих различной фармакологической активностью и позволяющих оказывать комплексное воздействие на все звенья развития воспалительных заболеваний пародонта, использовались нами при составлении методических рекомендаций по дальнейшей разработке рациональных прописей (схема 1).

Схема 1. Алгоритм действий по разработке рецептур сборов.

Разработка и стандартизация лекарственного сбора для леченяи и профилактики заболеваний пародонта.

Для внедрения в медицинскую практику новых лекарственных средств, в том числе сборов, необходимо проведение исследований по разработке пoказателей качества сбора, гарантирующих эффективность, безопасность, воспроизводимость действия, и, на основе полученных результатов, создание проекта ФС. Сложный состав биологически активных веществ предлагаемого сбора, включающего 7 растительных компонентов, делает целесообразным постановку вопроса об их стандартизации по комплексу биологически активных соединений, доминирующих в сборе и преимущественно обусловливающих фармакологический эффект. Также необходимо провести их фармакогностическое изучение для установления качественного состава, количественного содержания основных групп биологически активных веществ и разработки метода стандартизации.

Разработка технологической схемы получения сбора.

Схема получения сбора (Схема 2) была разработана на основании общепринятых технологических операций для изготовления данной лекарственной формы в соответствии с требованиями стандарта ОСТ и «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств».

Схема 2. Основные стадии технологического процесса.

Характеристика доброкачественности и подлинности сбора.

Для установления критериев подлинности сбора, содержащего растительное лекарственное сырье, относящееся к различным морфологическим группам, проводили изучение его внешних и анатомо-диагностических признаков с помощью макро - и микроскопического методов анализа. Установлены наиболее значимые диагностические признаки, которые использовались при разработке нормативной документации (проект ФС).

Результаты определения товароведческих характеристик сбора представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели качества сборов

Показатели качества анализируемого сбора	Обнаружено при анализе	Рекомендуемая норма
I 2005	II 2006	III 2007
Влажность, %	8,85%	9,25%	9,55%	не > 14%
Зола общая, %	8,26%	8,32%	8,34%	не> 13%
Зола, нерастворимая в 10% растворе НСl, %	2,57%	2,59%	2,57%	не > 5%
Количество частиц, не проходящих сквозь сито с d=5 мм, %	5,9%	6,4%	6,9%	не>10%
Примеси органические, %	0,19%	0,18%	0,18%	не > 2%
Примеси минеральные, %	0,029%	0,030%	0,030%	не> 1%

Учитывая, что в состав сбора входят компоненты, содержащие эфирные масла, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты, полисахариды и сапонины, наше внимание при проведении анализа было уделено в первую очередь указанным группам.