Лекционный курс по частной вирусологии Часть третья (стр. 13 )

Для ИФ диагностики ИГС применяли меченый конъюгат против вирусного перитонита кошек. Такие конъюгаты готовили из перитонеальной жидкости больной кошки с титром AT в жидкости не ниже 1:2560. Конъюгат анти-ВИГС получают из иммунной сыворотки поросят, свободн. ых от патогенной микрофлоры, титр AT 1:256. При исследовании срезов слизистой оболочки тонкого кишечника поросят, зараженных вирусом, получены одинако­вые результаты с конъюгатом анти-ВИПК и анти-ВИГС равной интенсивности свечения. При исследовании с помощью конъюгата анти-ВИГС срезов селезенки кошек, зараженных ВИПК, получены отрицательные результаты. Это свидетельствует об одн. остороннем анти­генном родстве между этими вирусами. Таким образом, для диагностики ИГС можно с ус­пехом использовать конъюгаты анти-ВИПК. Поскольку наличие у кошек AT к вирусам сви­ней маловероятно, перитонеальная жидкость, полученная при заражении вирусом перитони­та, может служить хорошим препаратом для изготовления диагностического конъюгата. Конъюгаты к ВИГС, полученные из иммунной сыворотки поросят, могут давать неспецифи­ческую флюоресценцию.

Для диагностики ИГС ИФ в качестве источника AT предложено иммунное молозиво. Показано, что концентрация иммуноглобулинов в молозиве даже выше, чем в сыворотке крови. ИФ как метод диагностики имеет ряд проблем, главная из которых наличие перекре­стной реакции с ВИПК, КВС и РКВС. Поликлональные AT не дифференцируют ВИГС и РКВС, некоторые монАТ реагируют с ВИГС и не реагируют с РКВС. Такая дифференциа­ция может быть проведена как в ИФ, так и в ИФА (52, 111). РКВС обнаруживается в респи­раторных тканях и эпителиальных клетках носовой полости, но тем не менее для дифферен­циации необходимо использовать монАТ, поскольку ВИГС может также реплицироваться в указанных органах.

РН. При выделении вируса в культуре клеток его идентификацию проводят с помощью РН, используя 1000 ТЦДзо вируса и 20 нейтрализующих доз сыворотки. Помимо культуры клеток для идентификации вируса, изолированного в биопробе, ста­вят РН на восприимчивых поросятах в возрасте 1-5 дн..

ВИЭОФВ. Вирус ИГС образует 1-2 линии преципитации с гомологичными сыворотками и может быть легко выявлен в экстрактах из содержимого кишечника экспериментально зараженных поросят. Богатая АГ структура (наличие трех АГ с различ­ной электрофоретической подвижностью) позволила использовать для его обнаружения мо­дифицированную методику ВИЭОФ (двойной ВИЭОФ), повышающую результативность.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика

РН. Диагноз на прошедшую инфекцию обычно ставят при помощи РН в культуре кле­ток, определяя титры ВНА в сыворотках крови реконвалесцентов. Для этого используют по­стоянную дозу вируса (100-1000 ТЦД5о) и двукратные разведения испытуемой сыворотки, которую предварительно инактивируют 30 мин при 56°С. Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед.. Титры AT у перебо­левших животных могут колебаться от 1:8 до 1:1280. ВНА обычно появляются на 7-8-й день после заражения и циркулируют в крови 18 мес.. На 14-й день титр их у свиноматки, 3-дн. и 3- нед. поросят достигает 1:128 - 1:1024, a y отъемышей и откормочных свиней - 1:32 - 1:256. С 3-4 мес.. титр медленно снижается, через год он уже на 2-3 разведения ниже максимально­го. У некоторых свиноматок, наоборот, титр AT резко снижается. Колостральные AT o6ычно исчезают у поросят в возрасте 3-4 мес., и обнаруженные у животных в это время ВНА следует относить за счет инфекции.

Для выявления и титрования AT предложен микрометод РН с использованием микро­планшетов. Сначала готовят двукратные разведения исследуемых сывороток (от 1:4 до 1:256) в объеме 0,05 мл, затем во все лунки микропипеткой вносят по 0,05 мл вируса, со­держащего 100 ТЦД50. После часовой инкубации при комнатной температуре во все лунки вносят по 0,05 мл суспензии клеток почек или щитовидной железы свиней в концентрации 300 тыс. клеток в 1 мл питательной среды, содержащей 30% инактивированной телячьей сыворотки. Пластины с культурой клеток выдерживают в термостате при 37°С в течение 4 дн. с 5% CO2 . Контролем РН служат 8 лунок с незараженной культурой клеток. Реакцию учитывают через 48-96 ч при условии наличия ЦПД в лунках, инфицированных вирусом в разведении 10-1 и 10-2, и в лунках, инфицированных смесью вируса с отрицательной сыво­роткой, и при отсутствии ЦПД в лунках, инфицированных смесью вируса со специфической сывороткой, и в лунках, не зараженных вирусом. Положительными считают сыворотки, ко­торые в разведении не ниже 1:4 полностью нейтрализуют 100 ТЦД50 вируса. Тест нейтрализации бляшкообразования более чувствителен, чем РН. Титр AT в нём ко­леблется от 1:100 до 1:5000, а в РН - 1:10 до 1:160.

РНГ. Используют для определения AT в парных сыворотках крови больных животных, а также для контроля за эпизоотическим состоянием племенных хозяйств-репродукторов в отношении гастроэнтерита. При этом у 5% поголовья 2 раза в год выборочно исследуют сы­воротку крови на наличие AT к вирусу. РНГА ставят в макро - и микровариантах по обще­принятой методике. Положительными считают сыворотки, которые в разведении 1:16 и выше вызывают агглютинацию эритроцитарного диагностикума. РНГА более чувствитель­на, чем PH. AT у заражённых поросят выявляются на 4-й день. РНГА используют как для подтверждения клинического диагноза, так и для выявления скрытых форм болезни и вирусоносительства. Реакция позволяет выявлять антитела к ВИГС в 2 раза чаще, чем РН. В бывшем СССР разработан эритроцитный диагностикум, с помощью которого можно вы­явить специфические AT у вакцинированных и больных ИГС.

ИФ. Описана модификация этого метода, обеспечивающая быстрое выявление и титро­вание AT к ВИГС. Сущность её заключается в приготовлении большого количества тефлонизированных стёклышек с лунками, содержащими АГ ВИГС. Их получают путём посева в лунки смеси инфицированных и неинфицированных клеток перививаемой линии свиных тестикулов. Стёклышки помещают в чашки Петри, которые инкубируют 16-18ч в термоста­те с газовой смесью воздуха, содержащей 5% CO2. Около половины клеток в каждой лунке оказывались инфицированными вирусом, что обеспечивает контрастность, помогающую определить специфическую флюоресценцию в присутствии разной степени фонового окра­шивания. После фиксирования ацетоном стёклышки можно хранить до использования в НИФ при минус 20°С. Сравнение этой модификации с РН, показывает что по чувствитель­ности она не уступает, обладая рядом преимуществ: быстротой получения результатов (3 ч по сравнению с 4-6 да для РН); простотой постановки; значительно меньшим расходом культуры клеток; возможностью хранения полученных препаратов в замороженном состоя­нии в течение нескольких месяцев. Важным оказалось также то обстоятельство, что токсич­ность исследуемых сывороток, часто существенно осложняющая проверку их в РН, не явля­ется препятствием для получения результатов.

РДП. Позволяет выявлять AT к ВИГС. АГ в данной реакции служит щелочной экстракт содержимого кишечника поросят, зараженных ВИГС.

ELISA. Успешно используется для выявления и количественного определения сыворо­точных AT к ВИГС. При исследовании сывороток от поросят, инокулированных культуральным или кишечным ВИГС, ELISA выявлял AT к вирусу в среднем на 3 дня раньше, чем РН при исследовании проб сывороток от поросят, заражённых культуральным вирусом, и на 1 день раньше при обследовании сывороток от поросят, заражённых кишечным виру­сом, причём титры AT в ELISA превышают титры ВНА. Имеются и другие достоинства ELISA по сравнению с РН, в частности, на результаты реакции не влияет присущая некото­рым полевым сывороткам цитотоксичность. С 1981 г. этот тест в двух вариантах - косвен­ный и послойный (двухсэндвичный) - успешно используется в ветеринарной практике в Италии. Интересно, что с его помощью можно количественно оценивать Ig 3 классов: G, М и А.

РТГА. ВИГС обладает ГА активностью в отношении эритроцитов цыплят, морских свинок и КРС, но не агглютинирует эритроциты гусей и мышей. Наиболее высокие титры ГА отмечены при 4°С. Поскольку специфическая антисыворотка к вирусу ингибирует ГА, то для серодиагностики ИГС можно использовать РТГА. Титры гемагглютининов в свиных сыворотках коррелируют с титрами ВНА. РТГА с культуральным вирусным АГ ставят на физиологическом р-ре (рН 7,2) с эритроцитами морской свинки в концентрации 0,6% при температуре смеси 4°С, учёт реакции проводят через 1,5-2 ч. Установлена зависимость ГА активности вируса от его инфекционной активности. Определены оптимальные условия по­становки РТГА для обнаружения AT к вирусу ИГС в сыворотках крови свиней. Показана пригодность ее для исследования полевых материалов - сывороток крови и молока свинома­ток на наличие специфических к ВИГС AT. Выявлена корреляция между уровнем AT, вы­являемых в РТГА, и иммуноферментным методом.

Дифференциальная диагностика. В полиэтиологической структуре вирусных гастро­энтеритов свиней доминируют рота - и коронавирусы, вызывающие диарейный синдром. ИФА даёт возможность проведения широкого эпизоотологического анализа и дифферен­циации указанных болезней.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

При ИГС имеет значение местный иммунитет кишечника, так как гуморальные AT не защищают животного от заражения. У переболевших свиней иммунитет сохраняется более 2 лет. У поросят он слабый и непродолжительный. Изучена роль респираторных и кишечных лимфоидных тканей в создании иммунитета против ВИГС. Вероятно при защите от этой инфекции большое значение имеет появление IgA после перорального введения ВИГС. Специфическая профилактика ИГС несмотря на свою многолетнюю историю все еще остается актуальной проблемой.

Пассивная иммунизация и её механизм мало изучены. IgA молозива образуются в результате стимулирования иммуноцитов, мигрирующих в молочные железы. Вакцинация супоросных свиноматок возможна аттенуированными, авирулентньми и субъе­диничными вакцинами орально, интраназально, внутримышечно и внутрь молочной железы. По аналогии с естественным путем заражения используют сочетанную оральную и интраназальную вакцинацию, хотя и она часто не оправдывает надежд. Новорожденных поросят или поросят-сосунов вакцинируют орально, чтобы инду­цировать быструю защиту посредством интерференции или стимулирования локального иммунитета, что в некоторой степени облегчает контроль эпизоотической ситуации. Вакцинация свиноматок, ранее инфицированных ВИГС, в ряде случаев приводит к значи­тельному увеличению продукции IgA и IgG и обеспечивает лучшую защиту поросят, что приемлемо при энзоотическом ИГС.