Лекционный курс по частной вирусологии Часть третья (стр. 8 )

Mr (вирион) 400 x 106; плавучая плотность в сахарозе 1,15-1,20 г/см3, в CsCl 1,23-1,24 г/см3, S20w 300-500S. Вирионы чувствительны к нагреванию, воздействию жирорастворителей, неионных детергентов, формальдегида, окислителей и УФ облучению. После инкубирования при 37 оС в течение 24 часов наблюдалось десятикратное снижение инфекционности некоторых штаммов. Ионы магния (1М) снижают степень термоинактивации у MHV. Некоторые вирусы обоих семейств стабильны при рН 3,0.

Геном. РНК: одна молекула, односпиральная, линейная, позитивная, инфекционная; размер 27,6-31,0 kb (у коронавирусов). РНК коронавирусов имеет 5’-концевой кэп, предшествующий лидерному сиквенсу из 65-98 нуклеотидов и нетранслируемому участку (200-400 нуклеотидов). По 3’-концу нетранслируемый участок (200-500 нуклеотидов) предшествует поли(А). Вирионная РНК функционирует как мРНК и является инфекционной. Содержит 7-10 функциональных генов, 4-5 из которызх кодируют структурные протеины. Гены организованы в следующем порядке: 5’-полимераза-(HE)-S-E-M-N-3’ с различным количеством других генов, кодирующих неструктурные протеины (NS), несущественные для репликации в культуре. Сиквенс полных геномов определен для некоторых коронавирусов (MHV, TGEV, HCoV-229E).

Протеины.Вирионы имеют в своем составе крупный поверхностный гликопротеин (спайк-протеин, S, Mr 180-220 x 103), интегративный мембранный протеин (М, Mr 23-35 x 103), который интегрирует в оболочку вируса 3-4 сегмента, малый мембранный протеин (Е, Mr 9-12 x 103) и нуклеокапсидный протеин (N, Mr 50-60 x 103). Соотношение протеинов S/E/M/N для TGEV соответсвует 20:1:300:100. Протеин S крупный (1160-1452 аминокислоты), у некоторых вирусов разрезается до S1 и S2. Данный протеин участвует в прикреплении к клетке, гемагглютинации, слиянии мембран и образовании вируснейтрализующих антител. Иммунизация одним протеином S способствует развитию протективного иммунитета против некоторых вирусов (TGEV, MHV). Карбоксиконцевая часть протеина имеет суперскрученную структуру. Протеин М образован 225-260 аминокислотами и индуцирует образование a-интерферона. Коронавирусы содержат гемагглютинин-эстеразный протеин (НЕ, Mr 65x103), который формирует короткие поверхностные выступы. Этот, по-видимому, не играющий важной роли, протеин имеет рецептор-связывающий домен для 9-О-ацетилированной нейраминовой кислоты, обладает гемагглютинирующей и рецептор-разрушающей (нейраминат-О-ацетилэстераза) активностью. Протеин НЕ проявляет некоторую идентичность по аминокислотному сиквенсу с гемагглютини-эстеразным протеином вируса гриппа С. Протеин Е (80-109 аминокислот), вместе с протеином М, играет важную роль в процессе сборки вириона. Протеин N (377-455 аминокислот) фосфопротеин, участвующий в регуляции синтеза РНК, связывается с вирусной РНК и образует спиральный нуклеокапсид.

Неструктурные протеины обычно несущественны для вирусной репликации в культуре клеток или in vivo. Один необходимый неструкутрный протеин – репликаза, кодируемая геном 1, охватывающим 2/3 генома (18-22 kb). Предполагается, что репликазный ген кодирует протеин с Mr 740-800 х 103, который подвергается котрансляционному процессингу. Ген pol кодирует две ORFs 1a и 1b, которые перекрываются на несколько нуклеотидов. Для некоторых доменов внутри pol на основе гомологии по сиквенсу предполагают определнные функции: 2 папаиноподобных цистеиновых протеазы; химотрипсиновая пикорнавирусоподобная 3С протеаза; цистеин-богатый протеин, связанный с ростовым фактором; РНК-зависимая РНК-полимераза; домен связывния с нуклеозидтрифосфатами (NTP)/хеликазный; домен связывния с нуклеиновыми кислотами “цинковый палец” (zinc-finger).

Другие неструктурные протеины различаются у коронавирусов по названию и локализации. Локализация генов, кодирующих эти неструктурные протеины определена. Ген N обычно расположен по 3’-концу генома коронавирусов, за исключением TGEV, FCoV, CСoV, у которых этот ген предшествует 1-2 другим генам.

Другие компоненты вириона. Липидсодержащая оболочка вириона имеет клеточное происхождение. Протеин S (MHV, BCoV) и Е (MHV) также ацилирован. Протеины S и НЕ содержат N-связанные гликаны, протеин S сильно гликозилирован. Протеин М содержит небольшое число N - или О-связанных гликанов, в зависимости от штамма.

Организация генома и репликация. Примерно 2/3 геномной РНК составляет полимеразный ген. Место перекрываения между участками ORF1а и 1b является специфическим “скользящим” сиквенсом (7 нуклеотидов), имеющим псевдоузловую структуру (рибосомный сигнал перескакивания рамки) и необходимым для трансляции ORF1b. 3’-часть генома заключает гены, кодирующие структурные и неструктурные протеины. Организация генов неструктурных протеинов, которые расположены между генами структурных белков, различаются у разных коронавирусов. Предполагается псевдоузловая структура и для 3’-конца вирусной РНК.

Синтез вирусной РНК проходит через процесс РНК-зависимого синтеза РНК, в котором мРНК транскрибируется с негативных цепей. Непосредственно перед большинством генов располагается консенсусная последовательность UCUAAAC (для MHV) или близкая ей у других коронавирусов. Этот сиквенс является сигналом для транскрипции субгеномных РНК. В зависимости от вида вируса и вида хозяина коронавирусные мРНК могут быть 6-8 видов, различающихся по размеру. Наиболее крупная мРНК является геномной РНК, которая также служит в качестве мРНК для ORF1a и 1b; остальные – субгеномные. Начиная с наибольшей, все мРНК обозночаются номерами с 1 по 7. мРНК имеют блок нестед-структуру (nested-set structure), напоминающие геномную структуру. За исключением самых мелких мРНК, все мРНК полицистронные. Обычно, транслируется только 5’-ORF каждой мРНК. Однако есть исключения: некоторые мРНК, например, мРНК-5 MHV, мРНК-3 IBV и нуклеокапсидная мРНК BcoV транслируются с внутренней инициации с образованием 2-3 продуктов.

Коронавирусные мРНК имеют и другие уникальные структурные особенности: их 5’-конец имеет лидерный сиквенс (примерно 65-98 нуклеотидов), который образуется из 5’-конца геномной РНК. У вирусной геномной РНК по месту начала мРНК располагается короткий участок, который очень гомологичен 3’-концу лидерной РНК. Этот сиквенс составляет часть сигнала для транскрипции субгеномной РНК.

Синтез коронавирусной РНК происходит в цитоплазме с образованием промежуточных форм (негативных цепей). Обнаруживаются как полноразмерные, так и субгеномные негативные РНК, вид и число которых соответствует вирусспецифическим мРНК. 5’-конец негативной РНК содержит короткий учаток олиго(U). Субгеномные негативные РНК являются зеркальным отражением позитивных субгеномных РНК. Предложено много моделей транскрипции, но наибольшее понимание нашли пока две: транскрипция с лидерным праймированием и транскрипция через синтез негативных цепей. Модель “транскрипции с лидерным праймированием” предполагает, что вирусная геномная РНК сначала транскрибируется по всей длине в негативную РНК, которая, в свою очередь, становится матрицей для последующего синтеза субгеномных РНК. Лидер транскрибируется с 3’-конца негативной РНК и диссоциируется от матрицы с последующей ассоциацией с матричной РНК по различным сайтам начала мРНК, играя роль праймера для транскрипции вирусных субгеномных РНК. Предполагается, что этап перемежающейся (прерывистой) транскрипции происходит во время синтеза позитивных РНК. В противоположность этой модели, модель “перемежающейся (прерывистой) транскрипции во время синтеза негативных РНК” предполагает, что этап перемежающейся транскрипции происходит во время синтеза негативных РНК, приводя к образованию субгеномных негативных РНК, которые, затем, служат матрицами для синтеза субгеномных РНК. В этой модели межгенные сиквенсы геномной РНК в местах (сайтах) начала мРНК служат в качестве сигналов, терминирующих или определяющих паузу, при синтезе негативных РНК, и затем, вновь образованные субгеномные негативные РНК перескакивают на лидерный РНК-сиквенс 5’­-конца геномной РНК, который действует как праймер для трансляции.

Сигнал упаковки для РНК MHV локализован рядом с 3’-концом гена 1. Данный сигнал формирует шпилевидную структуру, определяющую упаковку дефектных или гетерологичных РНК внутрь вириона.

Коронавирусы претепевают рекомбинации с высокой частотой во время репликации позитивных и негативных РНК. Это особенно верно в отношении MHV. Более низкая частота рекомбинации описана для IBV и TGEV.

Сборка вирусных частиц вероятно начинается с образования рибонуклеопротеина (RNP), взаимодействующего с компонентами корового чехла. Созревание вирионов происходит в циитоплазме путем почкования через эндоплазматический ретикулум и других пре-Гольджи мембран. Взаимодействие между протеинами М и Е является ключевым событием в сборке вирусных частиц. Протеины S и НЕ не являются существенными для формирования вирусных частиц.

Антигенные свойства. Иммунный ответ определен в отношении 4-х структурных протеинов (S, M, N и HE, если имеется). Доминирующими антигенами, участвующими в нейтрализации вируса, являются протеины S и НЕ. Снижение инфекционности антителами, специфичными протеину М, происходит, обычно, в присутствии комплемента. Защита от коронавирусных инфекций (MHV, TGEV) обеспечивается аффинно очищенным или рекомбинантным (экспрессируемым аденовирусом) протеином S. Антитела, специфичные протеинам M и N также обеспечивают некоторую защиту in vivo. Наиболее эффектиная индукция образования вируснейтрализующих антител достигалась при использовании комбинации протеинов S и N. Глобулярная часть протеина S содержит много доминантных антигенных сайтов, участвующих в механизмах гуморального и Т-клеточного (цитотоксического) иммунного ответа. Другие важные эпитопы обнаруживаются также на стволовой части (например, у MHV). Сильный иммунный ответ индуцируют как амино-, так и карбоксиконцевые участки протеина М. Если нейтрализующие антитела, имеющиеся до заражения, предотвращают развитие болезни, то ответ со стороны цитотоксических Т-клеток важен для элиминации вируса. Гипервариабельные домены части S1 протеина S облегчают селекцию вирусных эскейп-мутантов, которые уклоняются как от гуморального, так и от клеточного иммунного ответа. Протеин N участвует в развитии протективного клеточного иммунного ответа.