Лекционный курс по частной вирусологии Часть третья (стр. 6 )

Описано получение монАТ для диагностики КЧС на мышах линии BALB/c 4-кратно иммунизированных ВКЧС (шт. Альфорт). Клетки селезенки мышей "сливали" с миеломными клетками Sp2/0. Полученные гибридомы культивировали в 20% среде ДМЕМ Ну-Нт при 37°С в атмосфере 5% С02. Продуцирующую специфические AT культуру дважды субклонировали и после определения изотипа AT инокулировали интраперитонеально мышам BALB/c. Образующаяся асцитная жидкость содержала высокие концентрации монАТ, кото­рые после соответствующей очистки конъюгировали пероксидазой хрена.

Разработан способ изготовления иммуноферментных коньюгатов для ИФА с использо­ванием монАТ к ВКЧС с сохранением активности фермента и высокой специфической активностью иммуноглобулина, а также метод флюоресцирующих зондов (МФЗ), ко­торый не уступал по чувствительности и специфичности МФА. Разработан метод выявления ВКЧС методом молекулярной гибридизации и ПЦР.

Дифференциальная диагностика

КЧС необходимо отличать от африканской чумы, пастереллеза, сальмонеллеза, рожи, БА, ВД-БС, парагриппа и гриппа.

При африканской чуме ярче выражен геморрагический диатез, увеличена и размягчена селезенка, полнокровие и кровоизлияния в почках. Чаще поражаются, имея вид кровяных сгустков, портальные, почечные и брыжеечные лимфоуз­лы. Сильно выражен отек интерстициальной ткани легких, скопление в грудной полости кровянистой жидкости. Редко отмечают инфаркт селезенки, постоянно - тотальный распад лимфоцитов и тканей лимфоидных органов. Для дифференциации ставят тест перекрестного иммунитета, тест гемадсорбции и РИФ. Пастереллез, как правило, не принимает характера эпизоотии, поражает преимущест­венно взрослых животных. Для него характерны отек подкожной клетчатки подчелюстного пространства, распространяющийся на шею и глотку, серозный лимфаденит, фибринозно-некротизирующая пневмония, слабо выраженный геморрагический диатез. Кроме того, об­наруживают возбудителя при бактериологическом и биологическом исследованиях. Рожа обычно возникает в летний период года и характеризуется застойными явлениями кожи (рожистая эритема) и во внутренних органах, увеличением селезенки, гломерулонефритом и катаральным гастроэнтеритом. Рожу свиней диагностируют выделением возбудите­ля. Не исключено одновременное течение чумы и рожи. В этом случае диагноз ставят на ос­новании биологической пробы на чуму и бактериологического исследования на рожу. Сальмонеллез наблюдают спорадически и энзоотически среди молодняка 1-5-мес. воз­раста. Характеризуется слабым геморрагическим диатезом, развитием в толстом кишечнике плоских рыхлых струпьев и язв, а не "бутонов", очаговыми некрозами печени. Результаты бактериологических исследований являются также основанием для дифференциации КЧС. Грипп и парагрипп свиней исключаются вирусологическим исследованием материала, взятого из верхних дыхательных путей (наличие ГА вируссодержащего материала в первых пассажах на КЭ, гемадсорбции в культуре ткани, цитоплазматических включений при ри-ноцитоскопии). Болезнь Ауески чаще наблюдается среди поросят. Проводят вирусологиче­ские исследования и биопробу на кроликах. Вирусную диарею у инфицированных устанавливают с помощью ПЦР, поскольку большой неструктурный протеин пестивирусов 125 кД высоко консервативен, а мажорный протеин конверта gm53 четко различается у ВКЧС и диареи КРС.

ИММУНИТЕТ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА

Животные-реконвалесценты приобретают стойкий иммунитет, продолжающийся не­сколько лет. Пассивный иммунитет непродолжителен - до 10-12 дн.

Применение живых вакцин. Иммунитет при КЧС обусловлен ВНА. Иммунные реак­ции, направленные на цитолиз инфицированных клеток, не «работают» при КЧС из-за от­сутствия экспрессии вирусспецифических белков на клеточной поверхности. Однако форми­рование резистентности к заражению вакцинированных свиней происходит до выявления ВНА. Лейкоциты и лимфоциты иммунизированных свиней способны лизировать аутогенные клетки-мишени (лейкоциты), интегрировавшие вирионы КЧС. Однако эти же клетки либо вовсе не вызывали цитолиз незараженных лейкоцитов, либо лизировали их в меньшей сте­пени. Поэтому весьма вероятно, что в защите от КЧС наряду с нейтрализацией вируса AT важную роль играют иммунологические реакции, опосредуемые клетками, в частности ЕК (естественные киллеры) и ЦТЛ (цитотоксические лимфоциты). С 70-х гг. в арсенале средств специфической профилактики КЧС первое мес. то занимают живые вакцины из шт. К и ЛК-ВНИИВВиМ. Лучшая из отечественных - вакцина ЛК-ВНИИВВиМ, получена на основе шт. К ВКЧС, который репродуцируется в гетерологичной системе - культуре клеток тестикулдрной ткани ягнят. Препарат обладает высокой иммуногенностью и полностью лишен вирусных контаминантов, патогенных для свиней. Вакцина не уступает по активности лучшим миро­вым аналогам - вирус вакцине GPE (Япония) и Phiverval (Франция), но и превосходит их по универсальности применения и потенциальной безвредности. Все характеристики вирус-вакцины ЛК-ВНИИВВиМ соответствуют требованиям Европейской фармакопеи и общепри­знанным мировым стандартам. С помощью живой вирус-вакцины ЛК-ВНИИВВиМ можно создавать специфическую защиту от заболевания и гибели 100% вакцинированных свиней уже через 48 ч после 1-кратного внутримышечного введения ее в дозе 6,0 lg ИмД50/гол. Вакцина может быть с ус­пехом использована для обрыва инфекции в неблагополучных хозяйствах и до минимума сократить экономический ущерб. Вакцина из шт. К ранее репродуцировалась в организ­ме кроликов, в настоящее время её размножают в культуре клеток почки эмбриона свиньи. Во ВНИИВВиМ разработан и испытан с положительным эффектом способ пероральной вакцинации новорожденных поросят против КЧС. Единственным и обязательным условием является вакцинация тотчас после рождения до контакта с инфицированной средой и до 1-го приема молозива. Поросят допускают к соскам матки не ранее, чем через 30 мин после вак­цинации последнего поросенка. В силу строения плаценты ни один класс AT, циркулирующих в организме свиноматки, не передается плоду. Поросята рожда­ются от иммунной свиноматки абсолютно интактными, практически стерильными и имму-нологически компетентными. Вакцинировать подсосных поросят, уже получивших молозиво иммунных свиноматок, бессмысленно, так как при наличии колостральных AT поствакцинальный иммунитет у поросят не формируется. Вынужденная вакцинация поросят отъемно­го возраста чревата риском провокации инфекции, так как нейтрализуя остатки материнских AT, вакцина лишает поросят возможности защищаться в инфицированной среде. Следова­тельно, вакцинировать поросят до отъема еще рано, а после отъема уже поздно. Поэтому чрезвычайно важно поросенка вакцинировать перорально до сосания, т. е. практически тот­час после рождения и до контакта его с инфицированной средой, упреждая таким образом внедрение патогенного вируса.

При пероральном введении вакцинный вирус проникает в организм через естественные ворота инфекции, где организм биологически подготовлен к встрече с агентом, благодаря мощным лимфоидным образованиям глоточного кольца, которые сразу же запускают им­мунный процесс. Кроме того, вакцинный вирус, блокируя чувствительные рецепторы, под­чиняя метаболизм клетки и ее энергетический потенциал регулирующему влиянию генома вакцинного вируса, лишает полевой вирус обязательных условий, необходимых для проник­новения и репродукции. Срабатывает механизм упреждения. Таким образом, ни последую­щее инфицирование поросят полевым вирусом, ни массированное поступление с молозивом AT не способны прервать или повлиять на формирование полноценного (с секреторным компонентом) иммунитета против КЧС. Установленно, что 1-кратной пероральной вакцинации новорожденных поросят живой вирус-вакциной (ЛК-ВНИИВВиМ) дос­таточно, чтобы защитить их от заболевания в течение всего технологического цикла выра­щивания вплоть до сдачи на мясокомбинат.

Применение инактивированных вакцин. В прошлые годы профилактика КЧС осно­вывалась на применении кристаллвиолетвакцины, которая, несмотря на ряд недостатков, в свое время играла положительную роль в санации хозяйств от данной инфекции. С 1967 г. этот препарат в хозяйствах Российской Федерации и стран СНГ не применяется, хотя мысли о возможности получения инактивированного и абсолютно безвредного препарата продол­жают поддерживаться. Так, например, и и соавт. пока­зали, что ВКЧС, выращенный любыми технологическими приемами, надежно инактивировался сернокислой медью (3-5 мМ) при 37°С в течение 98 ч с сохранением иммуногеиных свойств. Использование других инактивантов (глутаральдегид, димер этиленимина, тритон Х-100) не обеспечивало получения иммуногенных препаратов в нативном виде (максимальная доза АГ). Автором разработана инактивированная вакцина против КЧС, содержа­щая культуральный материал вирулентного шт. Ши-Мынь, сернокислую медь в качестве инактиванта и гидроокись алюминия. Вакцина создавала 100%-ную защиту привитых животных от контрольного заражения вирулентным вирусом (1000-10000 ЛДдо), в то время как аналогичные препараты из шт. ЛК обеспечивали, в общей сложности, 30%-ную защиту. Во Франции разработана инактивированная вакцина против КЧС. Культуральный вирус инактивировали глутаральдегидом (0,01-0,001%-иым при 25-35°С в течение 4-7 ч), а затем эмульгировали в масляном адъюванте. Во ВНИТИБП были получены опытные образцы инактивированной вакцины против КЧС из шт. Гудзон, выращенного в культурах клеток РК-15, ПЭКр и первичной культуре клеток почки поросенка. Вирус инактивировали этиленимином и эмульгировали с разными масляными адъювантами. Вакцина обеспечивала 75-100%-ную защиту в экспериментальных условиях при контрольном заражении /10000 ЛД5о. Имеется патент на вакцину, содержащую полипептид вируса КЧС.

О генноинженерной вакцине против КЧС. В 1991 г. было осуществлено встраивание генов гликопротеинов ВКЧС в вектор (вирус осповакцины). Полученный рекомбинантный вирус оказался высокоиммуногенным. На поверхности клеток зараженных ВКЧС обна­ружены гликопротеины ЕО и Е2. Устойчивыми к контрольному заражению оказались только те животные, которые были привиты рекомбинантным вирусом вакцины, экспрессирующим ЕО и(или) Е2 . В настоящее время получен рекомбинатный аттенуированный вирус БА, зкспрессирующий gp55 (E2) вируса КЧС. Он вызывал у свиней выраженный иммунитет против обоих вирусов. Иммунизация свиней белками ЕО и Е2, полученными в оспенно-бакуловирусных системах, также защищала свиней от летальной инфекции вирусом КЧС.