Синтез, строение и антиоксидантная активность фосфорсодержащих производных алкалоида цитизина Магистерская диссертация (стр. 11 )

Два третичных протона в положениях С7 и С9 у метиленового мостика не эквивалентны, так как протон при С7 находится в α-положении к двойной связи и подвержен влиянию анизотропии к ней, вследствие чего смещен в более слабое поле (δ 3.03-3.10 м. д.) относительно протона С9. А широкий синглет в области 2.43 м. д. принадлежит протону С9. Группа линий в области 1.91-2.03 м. д. относится к протонам при С11 и С13.Данные спектра ЯМР13С также подтверждают структура данного препарата.

С целью установления пространственного строения было проведено рентгеноструктурное исследование Цитафата (рентгеноструктурный анализ проведен в лаб. РСИ ИНЭОС РАН). Установлено, что координация атома фосфора в исследуемом препарате – искаженная тетраэдрическая, обычная для фосфатных группировок. Дигидропиридиновый цикл плоский, карбонильный атом кислорода отклоняется от этой плоскости незначителен. Тетрагидропиридиновый цикл принимает конформацию софы. Пиперидиновый цикл имеет почти идеальную конформацию кресла.

Спектральные данные методики №2:

В ИК-спектре соединения присутствуют интенсивные полосы поглощения, характерные для валентных колебаний  - СН3  группы - 2947 ср. антисимметричные колебания, 2848 ср. симметричные колебания; деформационные колебания - СН3-1456 ср. антисимметричные колебания,1355 ср. симметричные колебания; колебания ароматического кольца1576, 1544, 1456; С=С  сопряженная с  С=О  1654; валентные колебания СН -3050; деформационные колебания – СН - 788, 816, 832;

плоские деформационные колебания  1160, 1133; карбонильная группа С=О  1654; непредельные С=С - С=О колебания С-N группы  1116 сл.  и  деформационные колебания1578;  С-О группа-1254;колебания с участием Р-1071 колебания - Р - О – алкил;1187  колебания  Р - О - СН3 (рисунок 4.1).

При анализе ПМР спектра Цитафата три группы сигналов низкого поля соответствуют протонам α-пиридинового ядра. 1 Н1  6,33 миллионных долей, дуплет; 1 Н2  7,22 м. д., мультиплет; КССВ 3J = 6,9 гц;1 Н3  5,97 м. д., дуплет;1 Н4  2,33 м. д., у. с.,2 Н5  1,87 м. д., квартет;1 Н6 4,04 м. д., мультиплет;2 Н7  3,47 м. д., мультиплет; 2 Н8  2,95 м. д., мультиплет; 2 Н9  3,77 м. д., квартет; КССВ 3J = 6,6 гц.

Протоны ОСН3  проявляются в виде дублет дуплетов в области 3,269- 3,402 м. д. с КССВ 2J = 11,1 гц. Расположение оксиметильных групп в более слабом поле обусловлено влиянием со стороны атомов кислорода и фосфора (рисунок 4.2).

Рисунок 4.1- ИК-спектр О, О-диметил-N-цитизинилфосфата

Рисунок 4.2- ПМР-спектр О, О-диметил-N-цитизинилфосфата

4.4 Спектральные данные и данные рентгеноструктурного анализа лекарственного препарата «Цитафат» в условиях МВА

В ИК-спектр данного соединения абсолютно идентичен с ИК-спектром полученных в классических условиях. Присутствуют интенсивные полосы поглощения, характерные для валентных колебаний  - СН3  группы - 2947 ср. антисимметричные колебания, 2848 ср. симметричные колебания; деформационные колебания - СН3-1456 ср. антисимметричные колебания,1355 ср. симметричные колебания; колебания ароматического кольца1576, 1544, 1456; С=С  сопряженная с  С=О  1654; валентные колебания СН -3050; деформационные колебания – СН - 788, 816, 832; плоские деформационные колебания  1160, 1133; карбонильная группа С=О  1654; непредельные С=С - С=О колебания С-N группы  1116 сл.  и  деформационные колебания1578;  С-О группа-1254;колебания с участием Р-1071 колебания - Р - О – алкил;1187  колебания  Р - О - СН3 (рисунок 4.3). Общий вид молекулы О, О-диметил-N-цитизинилфосфата приведен на рисунке 4.4.

Рисунок 4.3- ИК-спектр О, О-диметил-N-цитизинилфосфата

Рисунок 4.4 – Общий вид молекулы О, О-диметил-N-цитизинилфосфата

4.5 Исследование антигепатотоксичной активности [76]

Фармакологическая активность О, О-диметил-N-цитизинилфосфата изучалась докторами медицинских наук , , аспирантами , , Карагандинской государственной медицинской академии. Все исследования проводились в соответствии с требованиями Фармакологического комитета Агенства Республики Казахстан по делам здравоохранения[77].

Расширенные антигепатотоксичные свойства Цитафата проводились в Карагандинской государственной медицинской академии. Первично были повторены  условия скринингового эксперимента. Первые результаты о лечебном эффекте Цитафата получены во ВНЦ БАВ (г. Москва), в котором показано, что у данного соединения присутствуют на клеточных культурах цитопротекторные свойства и способность увеличивать выживаемость мышей при остром отравлении ССl4. [76]. Результат: установлено, что предварительное введение  (за 1 ч)  Цитафат  в  дозе  100  мг/кг  защищает  от гибели 80% мышей при наблюдении на протяжении 5-ти суток. В группе нелеченных животных мыши гибли 100% на 3-4 сутки. В качестве препарата сравнения использован наиболее широко применяемый гепатопротектор – Эссенциале. Введение этого вещества в дозе 50 мг/кг (что является, в пересчете, высшей  терапевтической дозой  у  человека), также  защищало от гибели часть мышей, но процент выживших составил всего 20%. Эти данные позволяют считать исследуемое фармакологическое соединение более активным антигепатотоксическим средством, чем эссенциале, примерно в 4 раза.

Ввиду получения обнадеживающих  результатов было проведено более углубленное исследование фармакодинамики Цитафата на моделях поражения печени. Наиболее часто используемая модель острого ССl4-гепатита, было взято нами в качестве основной тестовой системы. Внутрибрюшинное введение крысам ССl4 в условиях нашего эксперимента приводило к гибели 3-х животных из 10-ти в первые сутки. Если же ССl4 предварительно за 1 ч до введения яда вводили исследуемое соединение Цитафата в дозе 100 мг/кг или препарат сравнения эссенциале в дозе 50 мг/кг, то количество выживших в 1 сутки из 8 участвовавших в эксперименте составило – 7.Результат: действие Цитафата при остром ССl4  гепатите выражается в уменьшении уровня в крови индикаторов цитолиза: в среднем на 30% снижается уровень АЛТ, АСТ; на 40% - общий билирубин; и на 12% - ЩФ, по сравнению с показателями крыс контрольной группы. В этой же ситуации стандартный гепатопротектор Эссенциале проявляет свое действие менее отчетливо: в среднем лишь на 20% снижает уровень АЛТ, АСТ; на 29% - ОБ, ЩФ – на 27%.

Поскольку, одним из наиболее вероятных механизмов гепатопротекорного действия является изменение уровня ПОЛ-АОЗ, то влияние Цитафата на систему также исследовано в условиях эксперимента. Судя, по показателям ПОЛ-АОЗ Цитафат значительно снижает степень липопероксидации при остром гепатите. Основные показатели, такие как ДК, КД снижаются практически до нормы. Но не приостанавливается рост конечных продуктов ПОЛ. На этом фоне Эссенциале действует несколько слабее, но также уменьшает все параметры ПОЛ. Интегральную характеристику уровня продуктов липопероксидации проводили по измерению площади под кривой хемолюминисценции эритроцитов. Исследуемое вещество уменьшает площадь под кривой на 43%; эссенциале на 21%, что свидетельствует об антиоксидантном эффекте обоих соединений и о превосходстве Цитафата перед эссенциале в условиях данного эксперимента. О возможном влиянии исследуемого соединения Цитафата на уровень активности микросомальных ферментов судили в тесте «гексаналовый сон».

В дозе 100 мг/кг Цитафата при однакратном введении видимо стимулирует микросомальные ферменты печени, судя по тесту с укорочением «гексаналового сна». Максимальный эффект развивается на 3 сутки. К 5 суткам действие препарата прекращается.

Таким образом, можно считать, что Цитафат обладает антигепатотоксическим свойством при остром отравлении ССl4, увеличивая выживаемость животных, защищая целостность структуры гепатоцитов, в основном  стабилизируя мембраны,  увеличивая  компенсаторно-приспособительные возможности клеток и их детоксицирующую функцию. Вероятно, в защитном действии Цитафата при отравлении гепатотропным ядом, может иметь значение и установленный нами факт индуцирования микросомальных ферментов печени в тесте «гексаналового сна». Кроме того, Цитафат обладает явным желчегонным действием на фоне токсического поражения печени. По данным параметрам Цитафат вполне сопоставим с эссенциале, известного как гепатопротекторный препарат.

При исследовании показателей системы ПОЛ-АОЗ установлено, что введение Эссенциале существенно снижает уровень липопероксидации, о чем свидетельствуют основные показатели ПОЛ (ДК, КД, ПП, СВ, ШО). Под влиянием Эссенциале повышается активность каталазы в плазме и снижается уровень средних молекул по сравнению с контрольной группой.

Применение Цитафата также положительно влияет на процессы свободно радикального окисления. Однако в меньшей степени, чем Эссенциале.

По данным исследования ультраструктуры ткани печени, Эссенциале обладает выраженным гепатопротекторным действием при отравлении крыс парацетамолом, что подтверждается снижением альтеративных изменений паренхимы и сохранением основных функций гепатоцитов. Однако, защитное действие Цитафата на фоне интоксикации парацетамолом прояляется большим числом признаков. Так, при введении Цитафата изменения в ткани печени были минимальными, по сравнению с контрольной группой и группой сравнения. Они характеризовались преимущественно дистрофическими изменениями в паренхиме и умеренно выраженными воспалительными изменениями в строме. По-видимому, гепатозащитное действие исследуемого препарата связано с сохранением структуры мембран печеночных клеток, что подтверждается относительно высоким уровнем активности исследуемых ферментов при парацетамоловой интоксикации.