Синтез, строение и антиоксидантная активность фосфорсодержащих производных алкалоида цитизина Магистерская диссертация (стр. 12 )

Морфометрические исследования, в целом, при сравнительном анализе гепатопротекторных свойств исследуемого препарата Цитафата и Эссенциале, при парацетамоловой интоксикации выявляют, что оба препарата обладают выраженным мембраностабилизирующим эффектом. Однако эффект Цитафата оказался, по данным морфологических, гистохимических и морфометрических методов исследований, более выраженным. Что подтверждалось увеличением активности ферментов окислительного фосфорилирования, неоглюкогенеза и гликолиза, повышением содержания гликогена в гепатоцитах, а также достоверным снижением альтеративных изменений в печеночной ткани и, как следствие, повышением репаративных процессов в ткани печени.

Таким образом, данные полученные на моделях острого токсического гепатита, вызванных ССl4 или парацетамолом, позволяют констатировать наличие у исследуемого вещества Цитафата антигепатотоксического эффекта, проявляющегося в антиоксидантных свойствах, мембраностабилизирующем действии и желчегонным эффекте. По основным параметрам Цитафата сопоставим со стандартным гепатопротектором Эссенциале и несколько превосходит последний.

Модель подострого токсического поражения печени вызывали ССl4. Проявлялся тот гепатит, выраженным нарушением окислительного фосфорилирования, гликолиза, развитием гидропической и жировой дистрофий в зонах детоксикации ксенобиотиков. Таким образом, получены доказательства антигепатотоксического действия Цитафата и при подостром токсическом гепатите.

Морфологические исследования проведены и на модели хронического токсического поражения печени мышей. При длительном сочетанном действии ССl4 и барбамида нами установлено, что у мышей формировался постнекротической цирроз печени, проявляющийся структурной перестройкой печеночной ткани, выраженными некротическими и дистрофическими изменениями гепатоцитов, снижением функциональной активности гепатоцитов и слабо выраженными репаративными процессами.

Длительное, в течение 1 месяца, применение через 1 день в дозе 100мг/кг в/б Цитафат препятствует развитию выраженного постнекротического цирроза. В ткани печени развиваются альтеративные некротические изменения гепатоцитов, центролобулярных отделов и 3 зоны ацинуса, но выраженные повреждения ядер клеток отсутствуют и судя, по гистохимическим данным, уровень биохимических процессов относительно сохранен. При введении эссенциале в печени отмечались признаки начинающейся цирротической перестройки, дистрофические изменения клеток были более выражены, чем у животных, леченных Цитафатом.

Таким образом, при экспериментальной желтухе при лечении Цитафатом в ткани печени крыс формируется септальный цирроз печени. Однако, по сравнению с контрольной группой, в ткани печени слабее выражены дистрофические и некротические изменериягепатоцитов, выражена репаративная возможность гепатоцитов и эпителия желчевыводящих путей. При лечении эссенциале в большинстве печеночных клеток отмечалось усиление углеводного и белкового синтеза на фоне деградации жировых включений и перехода жира в гликоген. Однако, часть печеночных клеток еще находилась в состоянии ранней стадии восстановления с деструкцией элементов специфического белкового синтеза. При микроскопическом исследовании, как и в двух предыдущих группах, в ткани печени отмечались цирротическая перестройка, полнокровие сосудов. При гистохимическом исследовании отмечалось умеренное повышение активности  ЛДГ, СДГ, Гл-6-ФДГ, КФ. Однако, по сравнению со случаем применения Цитафата, активность исследуемых ферментов была ниже. В зависимости от локализации в дольке, по ее периферии активность дегидрогеназ была меньше, чем в центре.

При морфометрическом исследовании, по сравнению с опытной группой (Цитафатом) отмечается достоверное увеличение объемной доли портальной стромы, доли некротизированных и дистрофированных клеток, а также увеличения объемной доли биллиардного тракта. Вместе с тем, отмечалось достоверное уменьшение объемной доли центральных вен и объема регенерирующих клеток. По сравнению с данными группы контроля, все перtчисленные морфометрические признаки уменьшены.

Таким образом, по данным ультраструктурного и морфологического, гистохимического и морфометрического исследования ткани печени, влияние Цитафата на морфофункциональные процессы выражалось явно. При применении Эссенциале положительные изменения также были заметны, но в несколько меньшей степени.

Видимо, Цитафат проявляет определенную активность и на фоне такого тяжелого поражения печени, как холестаз при механической желтухе, защищает клетки печени от повреждения и обеспечивает, большую компенсаторно-приспособительную реакцию.

Итак, в условиях нашего эксперимента зафиксировано профилактическое и антигепатотоксическое действие нового фармакологического соединения Цитафат на моделях острого поражения печени. Профилактическое и лечебное антигепатотоксические эффекты присуще также Цитафату и в условиях подострого и хронического поражениях печени (хронический гепатит, цирроз).

Цитафат обеспечивает до определенной степени защиту клеток печени и при механической желтухе. Во всех случаях действие Цитафат сопоставимо с эффектами стандартного гепатопротектора Эссенциале.

Можно констатировать следующие эффекты Цитафата:

антиоксидантный; мембраностабилизирующий; способность индуцировать микросомальные ферменты печени; желчегонный.

По всем перечисленным параметрам Цитафат можно считать гепатопротектором, более эффективного действия, чем существующий препарат Эссенциале. Перспективность данного фармакологического соединения представляется безусловной.

Исследование безопасности Цитафата и оценку токсичности проводили в соответствии с требованиями CLP и рекомендациям международных органов по стандартизации. 

Острую неспецифическую токсичность определяли на белых беспородных мышах весом 18-20 г в количестве 130 голов, крысах белых массой 160-180 г в количестве 40 голов и митохондриях, выделенных из диплоидных клеток культуры фибробласта человека. Летальные дозы определялись для 3 путей введения в/в, в/б и введения peros. Расчет летальной дозы 10% колеблется в пределах 1000-2000 мг/кг, LD50 – 1400-4000 мг/кг,  LD98 – 3350-8000 мг/кг. По этим показателям Цитафат можно отнести к соединениям с невысокой токсичностью. Средняя летальная доза Цитафата равна при введении внутрь 4300 мг/кг (3200:5800), средняя летальная доза при в/в введении 1800 мг/кг (1250:2550). Исходным соединением, которое служило для синтеза Цитафата является алкалоид цитизина, острая токсичность которого оценивается как относительно высокая. Сублетальная доза у мышей – 2 мг/кг. Высшая суточная доза для человека препарата цитизина – цититон составляет 1,2 мл, в пересчете 0,06 мг/кг. Видимо, введение фосфорсодержащих радикалов в молекуле цитизина приводит к снижению уровня токсичности.

В соответствии с параметрами токсикометрии Цитафата можно отнести к 4 классу токсичности для в/б введения. Для введения внутрь по ГОСТу 12.0.007.-76 относится к 3 классу токсичности. Таким образом, можно считать Цитафат малотоксичным фармакологическим соединением.

Цитафат в концентрациях от 0,1 до 1000 мкг/чашку не проявлял мутагенных свойств в тесте Эймсана стандартных тест-штаммах S. typhimurium TA 100, ТА 98 и ТА 1537. Установлено, в экспериментах на кроликах, проведенных стандартно, что раствор Цитафата в дозе 100 мг/кг в/в является апирогенным. При двухнедельном введении небольшое повышение t 0,4o С укладывается в физиологические нормы.

Аллергенных свойств у Цитафата по тестам с кожными аппликациями, конъюнктивальными пробами, ГЗТ не установлено. Цитафат не влияет на функциональную активность нейтрофилов в тесте фагоцитоза с дрожжами и НСТ-тесте при использовании полиморфно ядерных лейкоцитов человека.

Цитафат обладает собственной антимикробной активностью, обнаружено бактериостатическое и бактерицидное действие в отношении S. aureus, Proteusvulgaris, E. colli, Salm. enteritidis, Salm. abonu. Наиболее чувствительными являются грамположительные спорообразующие палочки Bacilussubtilis и Baciluscereus. Нечувствительными являются синегнойная палочка и грибы.

Таким образом, можно считать по средним летальным дозам для мышей, крыс и митохондрий культуры клеток человека фармакологическим соединением, относящимся к классу веществ с низкой токсичностью. Острая токсичность этого соединения существенно снижена по сравнению с исходным продуктом. Отсутствие выраженной токсичности в тестах подострой и хронической токсичности при введении терапевтических (50-100 мг/кг) доз, отсутствие мутагенных, иммунотоксических, аллергенных, пирогенных и эмбриотоксических свойств позволяет считать Цитафат относительно безопасным фармакологическим соединением при кратковременном введении.

Фармакопейным комитетом Агенства Республики Казахстан по делам здравоохранения утверждена Временная фармакопейная статья на субстанцию "Цитафат". Фармакологическим комитетом Агенства дано решение на проведение клинической апробации в качестве антигепатотоксического средства.

4.6 Гепатопротекторная активность О, О-диметил-N-цитизинилфосфата

Фармакологическое соединение лекарственного препарата «Цитафат» является полусинтетическим фосфорпроизводным природного алкалоида цитизин.        

Физические свойства:

Белый кристаллический порошок легко растворим в воде.

Рh 2%го водного раствора составляет от 4,0 до 5,0.

Температура плавления равна - 158-159 0С.

Удельное вращение от –199 до –201 0С.

УФ-спектр – максимум поглощения при 305±2мм и минимум при 231±2мм.

       Доклинические исследования проведены только при внутривенном и внутрибрюшинном введениях. В экспериментальных условиях гепатопротекторные свойства выявлены на моделях острого токсического гепатита вызванного  этиловым спиртом, аллиловым спиртом, парацетамолом, тетрахлорэтиленом,  аминазином и тетрациклином, а так же подострого и хронического  гепатитов вызванных тетрахлорэтиленом и фенобарбиталом. Препарат существенно удлиняет жизнь экспериментальных животных при механической желтухе. При введении препарата после гепатэктомии (удалении 2/3 массы печени) "Цитафат" значительно ускоряет регенерацию  клеток и обеспечивает быстрое восстановление функции печени  экспериментальных животных.