Биотехнологические основы производства кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения (стр. 5 )

Для выделения молочнокислых бактерий из различных источников рекомендован ряд сред. Это жидкие и агаризованные среды, в состав которых входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, томатный сок, дрожжевой экстракт и автолизат, белковые гидролизаты [23, 24]. Способность образовывать в качестве главного продукта брожения молочную кислоту является основным свойством молочнокислых бактерий, по которому их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов. Сбраживание углеводов по типу молочнокислого брожения, как правило, коррелирует с рядом других признаков. Молочнокислые бактерии неподвижны, не образуют спор, каталазонегативны, положительно окрашиваются по Граму, не образуют пигмент, не восстанавливают нитраты в нитриты [12]. Но нужно заметить, что некоторыми исследователями были описаны штаммы, которые по отдельным свойствам отличаются от типичных. Они подвижны, восстанавливают нитраты в нитриты, образуют споры, каталазоположительны [25, 26].

По форме клеток молочнокислые бактерии делятся на кокковые и палочковидные. Диаметр кокковых форм от 0,5—0,6 до 1 мкм; они располагаются единично, парами или в виде цепочек различной длины. Палочковидные бактерии разнообразны по форме — от коротких коккообразных до длинных нитевидных различной длины (от 0,7—1,1 до 3,0— 8,0 мкм), расположенные единично или цепочками.  На форму клеток значительно влияют состав среды и условия культивирования. Образование удлиненных палочковидных клеток наблюдается при развитии на средах, содержащих этиловый спирт, с высокой активной кислотностью, в средах с недостатком витамина В12, под действием ионизирующих излучений [27].

Высокие и средние дозы облучения гамма-лучами (порядка 100-300 тыс. рентген) двухсуточных культур Lb. ptantarumи Lb. brevisсильнее тормозят деление клеток, чем их рост. Поэтому в культурах непосредственно после воздействия облучением, как правило, образуются длинные палочковидные и нитевидные, а также дегенеративные раздутые формы клеток. Измененные клетки МКБ появляются и при воздействии лизоцима, при добавлении в среду веществ, снижающих поверхностное натяжение, а также антибиотиков [30, 31]. 

Удлинение формы клеток, их истончение и грануляция наблюдалась при культивировании отдельных молочнокислых бактерий (МКБ) на средах с высокой активной кислотностью (рН 3,7), при значительном содержании поваренной соли (до 6%), при температурах, намного превышающих оптимальные (45°С вместо 18°С). Такие же длинные, тонкие, гранулированные палочки нередко выделяются и из бродящих овощей, рассолов, вин, сусел, томатных продуктов.

У некоторых молочнокислых бактерий происходит образование удлиненных палочковидных клеток и при развитии их в средах с высоким содержанием этилового спирта, особенно, если среды слабо обеспечивают питание этих микроорганизмов [30]. В основном спирт подавляет функцию размножения клеток, функция же роста подавляется слабее.

Длина клеток у различных культур одних и тех же видов молочнокислых бактерий зависит в определенной степени от состава среды, присутствия кислорода, способа инкубации. Так, стрептококки (Lc. lactisssp. cremoris, Str, bovis)могут вытягиваться и напоминать палочковидные формы, а палочковидные бактерии - образовывать стрептококкоподобные цепочки (например, Lactobacilluscaseissp. easelLb. plantarum, Lb. brevis).Как указывает Мак Дональд [27], в культурах Str. cremoris(Lc. lactisssp. cremoris) и Str. lactis (Lc. lactisssp. lactis), выращенных в хемостате на среде с 2% молочного порошка (а также иных средах), обнаруживаются длинные нитевидные клетки. Это, очевидно, связано со снижением активности бактериальных аутолитических ферментов, участвующих в процессе расхождения образующихся при делении клеток.

Молочнокислые бактерии размножаются путем деления клеток, иногда перешнуровывания. Описан процесс размножения некоторых молочнокислых бактерий с помощью гонидий, при которых на концах палочек образуются зернышки (гонидии), увеличивающиеся в размерах, вытягивающиеся и превращающиеся в палочки, а также образование у молочнокислых бактерий фильтрующихся форм. Японскими исследователями доказано наличие у молочнокислых бактерий процесса спорообразования [26].

Если клетки делятся в одной плоскости, это приводит к образованию цепочек; когда же деление идет в двух плоскостях, образуются так называемые тетрады, характерные для бактерий рода Pediococcus.

Ряд исследователей приводит описание поверхностных колоний различных видов молочнокислых бактерий:

- термофильные молочнокислые палочки образуют шероховатые колонии;

- мезофильные гладкие, причем форма колоний коррелирует с другими признаками бактерий - способностью расти при определенной температуре и образовывать длинные, часто нитевидные или же короткие палочки [30].

Нередко можно наблюдать, что в культуре, наряду с шероховатыми колониями, имеются и гладкие, хотя последние со временем превращаются в шероховатые. Такое явление наблюдается, например, у L. acidophillus, причем гладкие колонии данного вида нередко ошибочно отождествляли с гладкими колониями Lb. caseissp. casei[31]. У бактерий рода Leuconostocнайдены S-, О - и R - типы колоний, среди R-типов можно установить еще несколько разновидностей.

Исследователями было сделано много попыток в направлении изыскания связи между способностью бактерий к образованию определенных типов колоний, их морфологическими признаками и физиологической активностью. Обзор этих работ приведен [12]. Изучению формы колоний молочнокислых бактерий уделялось большое внимание в период расцвета исследований диссоциации микроорганизмов. Многие авторы рассматривали переход одних форм колоний в другие как диссоциацию микроорганизмов, в основе которой лежат мутации. Другие ученые связывали превращения одного типа колоний в другие с условиями существования культуры, особенно с питанием [28].

Источником энергии для молочнокислых бактерий служит молочнокислое брожение, при котором АТФ образуется в процессе анаэробного окисления органических субстратов в ходе субстратного фосфорилирования.

Лактобациллы - микрофильные грамположительные бактерии, не образующие спор и не продуцирующие каталазу. На основании продукции  углекислоты из глюкозы, потребности в тиамине, ферментации фруктозы до маннита и продукции фруктозодифосфатальдолазы лактобациллы делят на две группы: гомо - и гетероферментативные [32]:

гомоферментативные бактерии при брожении сахаров образуют в основном молочную кислоту и незначительные количества фумаровой и янтарной, летучих кислот, этилового спирта и диоксида углерода;

гетероферментативные — наряду с молочной кислотой образуют значительно большие количества уксусной кислоты, этилового спирта, углекислого газа и других продуктов, используя на это 50% сахаров.

У некоторых молочнокислых бактерий, например, Str. faecalis, сбраживание углеводов протекает по схеме Энтнера - Дудорова.

Однако проведено значительное число исследований, указывающих на изменение характера конечных продуктов брожения молочнокислых бактерий в зависимости от ряда конечных факторов (рН, наличия углекислого газа и кислорода, физиологического состояния клеток), что свидетельствует о невозможности резкого разграничения групп гетеро - и гомоферментативных МКБ [33].

Молочнокислые бактерии относят к родам Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcusи Pediococcus[34-36].

Род Lactobacillusобъединяет палочковидные бактерии, среди которых есть гомо - и гетероферментативные виды.

Род Leuconostocобъединяет гетероферментативные кокковидные бактерии, имеющие овальную или яйцевидную формы.

Род Pediococcusобъединяет гомоферментативные кокковидные бактерии, деление клеток которых происходит в двух плоскостях, и в результате этого чаще всего образуются тетрады или гроздья.

Род Streptococcusобъединял ранее гомоферментативные кокковидные бактерии сферической или овальной формы, делящиеся в одной плоскости и располагающиеся парами или цепочками. Их делили на фекальные, молочные, оральные и пиогенные. В последнее время все молочнокислые стрептококки, согласно определителю Берги (IX изд.), выделены в род Lactococcus[37].

Наиболее распространенная гуппа бактерий рода Lactococcus— круглые или слегка овальные клетки диаметром от 0,5-0,6 до 1 мкм, расположенные единично, парами или цепочками различной длины. Бактерии рода Leuconostoc - удлиненные и яйцевидные, диаметром от 0,5 до 0,8 мкм и длиной до 1,6 мкм, иногда они имеют палочковидную форму длиной до 1-3 мкм, располагаются цепочками, не образуя кучкообразных скоплений клеток.

Виды Leuconostoc находятся на растениях и морфологически подобны стрептококкам. Они сбраживают сахара  гетероферментативно, то есть наряду с незначительным количеством молочной кислоты образуют также уксусную кислоту и ароматические вещества (ацетоин и диацетил). 

Образуются ацетоин и диацетил из солей лимонной кислоты. Однако аромат появляется только при рН ниже 5. Так как Leuconostoc сквашивает молоко в незначительной степени, то необходимо для появления аромата, сопутствующего процессу сквашивания молока, использовать культуру S. lactis.

Leuconostoc (раньше их называли бетакокками), которые являются ароматообразующими составными частями заквасок молочнокислых бактерий для приготовления масла. Они участвуют также в образовании аромата ломтевых сыров. Важнейшие их виды: Leuconostoc cilrovorum и Leuconostoc dextranicum.

В молочном хозяйстве лактобациллами называются грамположительные молочнокислые палочки. Они различной длины и толщины, не образуют спор и окисляют молоко значительно быстрее, чем стрептококки при рН 3,2—3,5. Лактобациллы достигают оптимального развития при низком значении рН и пониженном содержании кислорода. В соответствии с классификацией М. Берги в молочном хозяйстве все виды Tribus Lactobacilleae делятся на три рода: термобактерии, стрептобактерии и бетабактерии.

Молочнокислые бактерии обладают определенной протеолитической активностью, обусловливаемой действием протеаз и пептидаз. В процессе протеолиза белков молока, особенно в начале культивирования штаммов в молоке, происходит накопление аминокислот (аспарагиновой кислоты, глицина, серина, глутаминовой кислоты, треонина, тирозина, валина, фенилаланина, изолейцина), а также пептидов. Молочнокислые палочковидные бактерии обладают большей протеолитической активностью, чем кокковые формы. Так, Lb. bulgaricus, Lb. caseissp. caseiмогут переводить до 25-30% казеина в растворимую форму, тогда как Lc. lactisssp. lactisи Lc. lactisssp. cremoris - 15-17% [39, 40].