Биотехнологические основы производства кисломолочных продуктов лечебно-профилактического назначения (стр. 6 )

Молочнокислые бактерии обладают как эндогенными, так и экзогенными протеолитическими ферментами [41, 42]. Внеклеточный протеиназный фермент, продуцируемый Lc. lactisssp. lactis, по некоторым свойствам (оптимум действия, термостабильность) подобен трипсину. Наибольшая протеолитическая активность проявляется при реакции среды, близкой к нейтральной среде (рН 7,0). Вероятно, поэтому, нейтрализация молока мелом усиливает протеолитическую активность в течение всего инкубационного периода МКБ.

Помимо вне - и внутриклеточных протеолитических ферментов, у молочнокислых бактерий обнаружены протеазы, связанные с клеточной стенкой. Они осуществляют первоначальное действие на белки молока и играют существенную роль в обеспечении нормального роста бактерий в молоке. Исследованиями установлено, что протеолитическая активность Lc. lactisssp. lactis, Lb. helveticumи Lb. delbrueckiissp. lactis[43-45], обнаруживалась в первые часы брожения и в период активного размноженияклеток. Этот факт указывает на то, что процесс разложения казеина ведут ферменты, связанные с растущими бактериями, а не ферменты, выделяющиеся при автолизе клеток [44].

Рядом авторов показана прямая зависимость между степенью созревания сыра, его вкусом, ароматом и содержанием в нем свободных аминокислот, а также продуктами превращения этих аминокислот, накапливаемых протеолитически активными молочнокислыми бактериями [46].

Молочнокислые бактерии либо не обладают липолитической активностью, либо проявляют ее в определенной степени при воздействии на некоторые субстраты [47].

Следует отметить, что липолиз в сыре относится к сложнейшим многофакторным процессам, так как липолитическая система продукта неоднородна и способна к каталитической трансформации с образованием большого  количества  различных  соединений  [48, 49]. Данное обстоятельство в еще большей мере определяет необходимость установления основных закономерностей липолитических процессов в сыре, что является обязательным условием управления ферментативными реакциями при выработке продукта, а соответственно интенсивностью процесса его созревания и формирования органолептических показателей.

Установлено наличие у молочнокислых бактерий фосфолипазной активности, причем по этому признаку выявлены значительные межвидовые и внутривидовые различия. Качество многих ферментированных молочных продуктов зависит от способности микроорганизмов, входящих в состав закваски, продуцировать вкусовые и ароматические компоненты. Одним из таких компонентов является диацетил, отвечающий за «масляный» аромат молочных продуктов, а способность к его продукции в результате усвоения содержащегося в молоке цитрата свойственна бактериям из p. Lаctococcus и разным видам Leuconostoc [50, 51].

В течение последнего десятилетия много исследований посвящено выяснению механизма образования диацетила [52, 53]. Все штаммы МКБ, образующие диацетил, образуют ацетоин. Но не все штаммы, продуцирующие ацетоин, образуют диацетил.

Способность бактерий к усвоению цитрата и образованию диацетила является нестабильной, и, с довольно высокой частотой, появляются варианты, не образующие диацетил. Исследованиями было показано, что нестабильность связана с локализацией генов, определяющих ароматообразование (а также сбраживание лактозы, протеиназную активность, фагоустойчивость, продукцию низина и др.), на плазмидах [54, 55]. Утрата клетками той или иной плазмиды приводит к потере культурой того или иного свойства.

В целом, многие технологические свойства заквасочных штаммов молочнокислых бактерий являются нестабильными. К ним относятся способность к сбраживанию лактозы, протеиназная активность, фагоустойчивость, образование низина. Благодаря интенсивным исследованиям было показано, что нестабильность связана с локализацией генов, определяющих все эти свойства на плазмидах. Носительство плазмид — широко распространенное явление в мире микробов, их наличие придает клетке определенные преимущества. Плазмиды играют важную роль в эволюции бактерий, участвуя в процессе естественного отбора. Несмотря на разнообразие контролируемых функций клетки, плазмиды обладают рядом общих свойств: состоят из ДНК, имеющей кольцевую замкнутую структуру, расположены вне хромосомы и способны к саморепликации. Общим для всех плазмид свойством является то, что они придают клетке дополнительные, не обязательные для нее функции, но чаще всего выгодные. Утрата клетками той или иной плазмиды приводит к потере культурой того или иного технологического свойства. Плазмиды могут теряться бактерией или элиминироваться, однако потеря плазмиды не влияет на основные свойства клетки. Они могут подвергаться мутации, а также рекомбинировать между собой и хромосомой [50, 51].

Известен метод получения фагоустойчивой стартовой культуры для ферментации молока, включающий трансформацию пищевой лактобактерии с дефицитным по ферментации лактозы фенотипом, устойчивым к лакто - и стрептококковым фагам. Трансформация осуществляется посредством введения генетического элемента, несущего генетический локус лактозной ферментации. В результате получается трансформированная лактобактерия, обеспечивающая репликацию данного генетического элемента, способная к ферментации лактозы и не содержащая маркер устойчивости к антибиотикам [55].

Плазмиды, определяющие продукцию низина, как правило, бывают сцеплены  с  генами  усвоения  сахарозы,  а  размеры  плазмид  в  разных штаммах варьируют. Аналогичное можно сказать и о плазмидах, определяющих фагоустойчивость или протеиназную активность, и их размерах. Продукция диацетила также контролируется генами плазмидной ДНК, причем, на сегодняшний день все выявленные плазмиды имеют более или менее одинаковую массу.

Известно, что плазмидами детерминируются многие производственные свойства лактококков, такие как потребление лактозы, протеолитическая активность, ароматообразование, антагонизм в отношении бактерий других систематических групп, устойчивость к бактериофагам и др. Вновь появившиеся плазмиды, скорее всего, имеют эндогенное происхождение, т. е. генетический материал этих плазмид, возможно, не присутствует в хромосоме исходного штамма. Не исключено, что наблюдаемые изменения плазмидных профилей у других штаммов происходят в результате генетического взаимодействия между плазмидами и хромосомой.

В комплексе механизмов колонизационной устойчивости важную роль играет антагонистическая активность молочнокислой  культуры, ее способность колонизировать слизистую оболочку ЖКТ, которая складывается из адгезии микроорганизмов к эпителиальным клеткам кишечника, конкуренции за рецепторы связывания и блокады адгезии и колонизации слизистых с участием факторов как иммуноглобулиновой природы, так и факторов защиты организма хозяина. При  этом роль адгезинов у разных микроорганизмов выполняют поверхностно расположенные фимбрии, антигены белковой или полисахаридной природы, липотейхоевые кислоты, фосфолипиды и др. Процесс адгезии позволяет микробам удержаться в определенной нише, что обеспечивает возможность эффетивной колонизации слизистой ЖКТ симбионтами.

Следовательно, одним из способов предотвращения колонизации кишечника патогеном является подавление его прикрепления путем насыщения эпителиальных рецепторов лигандами адгезии симбионтов. Известно, что предварительная обработка энтероцитов кишечника фимбиальным антигеном адгезии непатогенного штамма, например, кишечной палочки, создает резистентность к инфицированию патогенными штаммами, обладающими этим же адгезином. Как показали исследования, процесс адгезии лакто - и бифидобактерий происходит за счет фимбриоподобных структур и компонентов клеточной стенки, по-видимому, белков наружной мембраны и липотейхоевой кислоты. Продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий, вероятно, были одними из первых антисептиков микробного происхождения народной медицины. Кисломолочные продукты применяли для лечения ожогов и ран [12].

И. Мечников выдвинул теорию, что молочнокислые бактерии способствуют улучшению здоровья и долголетию. Он предположил, что «кишечная аутоинтоксикация» и возникающие вследствие ее вещества могут быть продавлены с помощью модификации кишечных бактерий и замены протеолитических микробов, таких как клостридиум, производящих токсические вещества (включая фенолы, индолы и аммиак после переваривания белков), на полезные микроорганизмы. Он разработал диету с добавлением молока, ферментированного бактерией, которую он назвал «Болгарской палочкой». Теория оздоровления кишечника не утратила своего значения и в настоящее время [56-60].

Антагонистические свойства молочнокислых бактерий стали стихийно применять в практике уже в глубокой древности. Консервирующее действие молочнокислого брожения использовали при заквашивании овощей, фруктов, в силосовании кормов, засоле рыбы, хранении мяса. 

Бактерицидность молочнокислых продуктов и их полезное действие на организм человека и животных многие исследователи объясняли действием содержащейся в них молочной и других кислот (уксусной, муравьиной и т. д.),  спиртов,  перекисей  и  других  метаболитов,  накапливаемых молочнокислыми микробами в процессе их роста и развития. В основе действия таких метаболитов - снижение рН и ингибирование вследствие этого роста бактерий, вызывающих порчу пищи [61, 62]. Дальнейшие исследования явления антагонизма лактобактерий показали, что они являются продуцентами антибиотических веществ. Так, Lc. lactisssp. lactis, например, выделяют низин, Lc. lactisssp. cremoris - диплококцин, Lb. acidophilus - ацидофилин и лактоцидин, Lb. Plantarum - лактолин, Lb. Brevis - бревин, Lb. delbrueckiissp. bulgaricиm - булгарикан, Lb. gasseri - гассерицин А [61-72]  и ряд очищенных, но не названных веществ [73, 74]. 

Установлено, что антибиотические вещества лактобактерий характеризуются определенным спектром действия. Так, например, низин бактериостатически действует на пропионовокислые бактерии, стафилококки, сарцины и некоторые молочнокислые бактерии, но не подавляет рост дрожжей, плесеневых грибов и грамотрицательных бактерий. Механизм действия на клетки связывают со способностью его реагировать с сульфгидрильными группами и, таким образом, выключать действие ряда важных коферментов (глутатион, ацетил-коэнзим A) [75, 76].  Выделяемый ацедофильной палочкой антибиотик - ацидофилин угнетает развитие гнилостных бактерий, стрептококков и стафилококков, возбудителей брюшного тифа, паратифов А и В, дизентерии, туберкулеза и дифтерии. Опубликованы  исследования по изучению механизма действия низина и педиоцина на цитоплазматическую мембрану клеток; рассматривается влияние мембранного потенциала, рН, состава мембранных белков и липидов на специфичность и эффективность бактериоцинов, роль специфических аминокислот и структурных доменов бактериоцинов в их действии [77]. Лактоцидин активен против кислотоустойчивых бактерий, а также плесневых грибов. Лактолин задерживает рост Clostridiumtyrobutуricum, Saccharomycescarlsbergensis, Candidaalbicans. L. caseissp. сaseiобладает антагонистическими свойствами по отношению к кишечной и сенной палочкам, пиогенному микрококку, а также бактериям тифа и дизентерии [78].