Результаты исследования синтеза цитокинов в группе КП демонстрируют снижение активности Th-2-лимфоцитов (угнетение синтеза ИЛ-4), возможно Treg-лимфоцитов (подавление синтеза ИЛ-10), что может быть следствием проводимой этим пациентам десенсибилизирующей и иммуносупрессивной терапии с применением цитостатиков и глюкокортикоидов.
Особенности синтеза ряда цитокинов были проанализированы в связи с выявлением маркеров ВГ-8, определяемых методами ПЦР и ИФА.
Было обнаружено, что существует достоверная взаимосвязь (р=0,01) между выявлением антител IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 и низкими уровнями ИФН-α (Рис. 1). МЗ в
Рисунок 1. Распределение значений ИФН-α среди пациентов с СК при наличии/отсутствии антител IgG к ВГ-8.
Рисунок 2. Распределение значений РА-ИЛ-1 по признаку выявления ДНК ВГ-8 у пациентов с СК.
случае выявления IgG составило 0,0 пг/мл, а при отсутствии IgG – 12,38 пг/мл. Вероятно, это происходит потому, что активация вируса происходит на фоне падения иммунитета и снижения уровня ИФН-α.
Также была выявлена взаимосвязь (р=0,0015) между обнаружением ДНК ВГ-8 и повышенными значениями РА-ИЛ-1 (Рис. 2). МЗ РА-ИЛ-1 в случае ДНК-положительных пациентов составило 838 пг/мл, а в случае ДНК-отрицательных – 187,5 пг/мл, что, возможно, отражает реакцию макрофагов на воспалительные процессы в организме, так как РА-ИЛ-1 блокирует действие провоспалительного цитокина ИЛ-1, синтезируемого моноцитами/макрофагами.
Исследование интерферонового статуса у больных СК, КП.
Данные определения интерферонового статуса у пациентов с СК, КП и у 50 здоровых лиц представлены в таблице 4.
Представленные результаты свидетельствуют о снижении функциональной активности системы ИФН-α и ИФН-γ при СК и КП. У больных СК и КП анализ экспрессии генов интерферонов, определяемой методом ОТ-ПЦР, и их продукции, определяемой методом ИФА, не выявил отличия от здоровых людей, но нами отмечено снижение способности клеток крови больных продуцировать интерфероны и чувствительности к препаратам ИФН-α и ИФН-γ, определяемое биологическим методом. Причем, у больных СК отмечено в большей степени снижение чувствительности к препаратам ИФН-α, а у пациентов с КП – к ИФН-γ. Обращает внимание повышение уровня циркулирующего и спонтанно продуцируемого интерферона у больных СК и КП, что на фоне остальных данных, говорит о преобладании неактивной формы ИФН в крови пациентов. Соответственно, можно говорить о снижении активности системы интерферонов у больных СК и КП.
Определение лейкоцитов, особенности лейкоформулы.
Дисперсионный анализ выявил достоверное (р=0,006) повышение лейкоцитов у пациентов с КП. Медианные значения этого показателя у больных СК, КП и здоровых лиц составили, соответственно, 6,1x109/л, 13,1x109/л, 7,0x109/л. Различия по лейкоформуле оказались недостоверны (р=0,41).
Таблица 4. Определение интерферонового статуса у обследованных (р – уровень значимости).
Исследуемая группа ___________________________ показатель | Количество обследованных (в %) с нарушениями интерферонового статуса | |||
Саркома Капоши n=22 | Кожная патология n=22 | Здоровые n=50 | P= | |
Повышение уровня циркулирующего ИФН в плазме крови | 2/22 (9% больных) | 8/22 (36,4% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | 0,000023 |
Повышение спонтанной продукции ИФН | 2/22 (9% больных) | 6/22 (27,3% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | 0,000674 |
Снижение продукции ИФН-α | 20/22 (91% больных) | 22/22 (100% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | <0,0000001 |
Снижение продукции ИФН-γ | 22/22 (100% больных) | 11/22 (50% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | <0,0000001 |
Снижение чувствительности к препаратам ИФН-α | 13/22 (59% больных) | 5/22 (22,7% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | <0,0000001 |
Снижение чувствительности к препаратам ИФН-γ | 7/22 (32% больных) | 13/22 (59% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | <0,0000001 |
Снижение чувствительности к индукторам ИФН | 0/22 (0% больных) | 0/22 (0% больных) | 0/50 (0% обследуемых) | ___ |
Обнаружено, что у больных КП IgE был выше по сравнению с другими обследуемыми (р=0,03). МЗ IgE у пациентов с СК, КП и здоровых людей составило, соответственно, 38,5 МЕ/мл, 334,5 МЕ/мл, 57 МЕ/мл.
Статистический анализ не выявил достоверных различий у всех обследованных по уровню IgM (р=0,12), IgG (р=0,2), IgA (р=0,64).
Полученные данные исследования гуморального иммунитета обследованных соответствуют картине воспаления и аллергизации, наблюдаемые у пациентов с кожными заболеваниями, входящими в группу КП.
Противовирусная активность пептидов в отношении ВПГ-2.
Нами было проведено исследование антивирусных свойств 15 пептидов. Из данных, приведенных в таблице 5 видно, что все исследуемые пептиды почти в равной степени обладают выраженной противовирусной активностью в отношении ВПГ2. Противовирусное действие наблюдалось при обеих схемах введения, но более выраженный эффект наблюдался при использовании препаратов по лечебной схеме.
Таблица 5. Снижение инфекционности ВПГ-2 под действием пептидных препаратов in vitro.
№ | Препараты в концентрации 10-5 М | Титра ВПГ-2 (lg ТЦД50/мл) при схемах введения препаратов | |
Введение препарата совместно с вирусом | Введение препарата через 24 часа после заражения вирусом | ||
1. | Met-glu-his-phe-pro-gly-pro (семакс) | 3,5 | 3,0 |
2. | Thr-lys-pro-arg-pro-gly-pro (селанк) | 3,5 | 3,0 |
3. 4. 5. 6. 7. | -----lys-pro-arg-pro-gly-pro ---arg-pro-gly-pro pro-gly-pro --arg-pro Gly-pro-gly-pro | 4,0 | 3,0 |
8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. | Thr-lys-progly-pro pro-arg-pro-gly-pro Thr-lys- Thr-lys-pro Thr-lys-pro-arg--- -----lys-pro-arg-- --gly-pro Gly-pro-gly | 3,5 | 3,5 |
Референс-препарат Ридостин | 3,5 | ||
Контроль ВПГ-2 | 6,0 lg |
Было установлено, что при экстренной лечебной и лечебной схемах пептиды снижали инфекционный титр вируса на 3,5-4,0 lg ТЦД50 и 3,0-3,5 lg ТЦД50, соответственно.
Данные настоящих исследований показали, что практически все пептиды перспективны для дальнейших исследований в отношении герпесвирусной инфекции.
Изменение экспрессии генов цитокинов в клетках Vero под действием пептидов при экспериментальной герпетической инфекции in vitro.
В результате проведенных исследований экспрессии генов цитокинов в клетках VERO, зараженных ВПГ-2, было показано, что спектр синтезируемых клетками мРНК цитокинов значительно меняется под действием пептидных препаратов. Наиболее заметными оказались изменения в синтезе мРНК ИЛ-1β. Так, в результате применения пептидов совместно с вирусом экспрессия гена ИЛ-1β наблюдалась при введении в клетки 13 из 15 пептидов. Также повышение уровня транскрипции ИЛ-1β наблюдалось при использовании in vitro 10 из 15 пептидов через 24 часа после заражения. В контрольном образце клетки заражали вирусом без обработки пептидами и экспрессии гена ИЛ-1β в них не наблюдалось. Подобный характер изменения экспрессии гена ИЛ-1β соответствует ответу иммунной системы на воспалительный процесс, который мог бы наблюдаться в условиях целостного организма при воздействии на него данными пептидами и ВПГ. Кроме того, усиление синтеза ИЛ-1β на уровне транскрипции позволяет предполагать возможную активацию В-лимфоцитов и продукцию антител в макроорганизме.
Показано угнетение экспрессии гена ИЛ-4 при введении в клетки Vero совместно с вирусом 11 из 15 пептидов, при применении in vitro препаратов через 24 часа после заражения экспрессия подавлялась под действием 6 пептидов. В контрольных клетках, зараженных вирусом, не обработанных пептидами, наблюдалась экспрессия гена ИЛ-4 (см. Талицу 6). Подавление транскрипции ИЛ-4 может отражать способность пептидов влиять на дифференцировку Т-хелперов в Th-1-лимфоциты и угнетать функцию Th-2-лимфоцитов, что является оптимальной коррекцией иммунитета при вирусной инфекции в условиях организма.
Как видно из данных, представленных в таблице 6, под действием пептидов в ряде случаев наблюдалось угнетение экспрессии гена ИЛ-8 и активации транскрипции ФНО-α и ИЛ-18, которые в условиях макроорганизма синтезируются моноцитами/макрофагами, что может свидетельствовать о способности пептидных препаратов регулировать функции данных клеток.
Таким образом, обнаруженные закономерности в изменении экспрессии генов цитокинов позволяют прогнозировать антивирусное действие препаратов в отношении герпесвирусной инфекции на основании характерных изменений синтеза цитокинов в клеточной модели.
Определение потенциального эффекта пептидов на клетки крови больных генитальным герпесом ex vivo.
Проверка потенциального терапевтического эффекта препаратов проведена ex vivo согласно методике и соавт., 2005. Показано, что клетки крови больных герпетической инфекцией отвечали адекватной продукцией ИФН в ответ на индукцию определенными пептидами, т. е. при добавлении практически всех пептидов клеточная чувствительность пациентов с герпесвирусной инфекцией определялась в 30-70% случаев (Табл. 7).
Анализ изменения цитокинового профиля в лейкоцитах пациентов с генитальным герпесом показал специфическую картину изменения транскрипции цитокинов, отличающуюся от таковой в клетках VERO.
Отмечено подавление частоты экспрессии гена ИЛ-10, наблюдающееся в 80% случаев (12 из 15 пептидов), что, возможно, является признаком подавления функций Treg-лимфоцитов, супрессирующих иммунный ответ и подавляющих синтез ИФН-γ. Таким образом, снижение синтеза ИЛ-10 является признаком стимуляции клеточного иммунитета.
Обнаружена также активация транскрипции ИЛ-2 под действием 9 из 15 пептидов. Известно, что ИЛ-2 участвует в дифференцировки Т-хелперов в Th-1, что также явлется доказательством стимуляции клеточного иммунитета. Показано снижение экспрессии ИЛ-4 при действии 7 из 15 пептидов, что указывает на снижение функций Th-2-лимфоцитов.
Доказательством активации клеточного иммунитета также может служить активация кспрессии гена ИЛ-12 почти в 50% случаев (7 из 15 препаратов). ИЛ-12 также индуцирует дифференцировку Т-хелперов в направлении Th-1, и, следовательно, участвует в антивирусном ответе.
Обобщая эти данные, можно заключить, что исследование изменений цитокинового фона в клетках крови пациентов является критерием, позволяющим прогнозировать потенциальное иммуномодулирующее действие исследуемых препаратов при герпесвирусной инфекции.
Различия в спектре экспрессируемых генов цитокинов на модели VERO и в клетках крови пациентов объясняется разным происхождением клеток. Общим признаком оказалось угнетение экспрессии гена ИЛ-4, что, вероятно, является признаком изменения дифференцировки Т-хелперов и усиления клеточного иммунитета. Дальнейшие исследования на других клеточных и вирусных моделях, а также расширенное популяционное исследование позволит подтвердить эти закономерности и обнаружить новые взаимосвязи и прогностические факторы.
В настоящее время проблема подбора терапии для лечения герпесвирусной инфекции крайне актуальна. Существует необходимость расширения имеющегося арсенала лекарственных средств, так как герпесвирусы широко распространены и ассоциированы с многочисленными заболеваниями человека.
Исследование пептидных препаратов подтвердило их выраженный антивирусный эффект не только на основании снижения цитопатического действия на клетки, но и на основании признаков активации клеточного иммунитета, выявленное путем анализа экспрессии генов цитокинов. Подтверждена эффективность исследованных пептидов в отношении ВПГ2 in vitro и ex vivo. Анализ изменений в синтезе цитокинов предполагает возможность использования этих препаратов и в отношении других представителей семейства Herpesviridae. Таким образом, нами усовершенствованы критерии подбора терапевтических
№ | Структура пептидов | ИФН-α | ИФН-γ | ИЛ-1β | ИЛ-2 | ИЛ-4 | ИЛ-6 | ИЛ-8 | ИЛ-10 | ИЛ-12 | ИЛ-18 | ФНО-α |
Введение пептидов совместно с вирусом | ||||||||||||
1. | Семакс | - | + | + | + | - | + | + | - | + | + | - |
2. | Селанк | - | + | + | +/- / | - | + | +/- | - | - | + | - |
3. | Thr-Lys-Pro-Gly-Pro | - | + | + | +/- | - | + | - | - | - | - | - |
4. | Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro | + | + | + | +/- | - | + | + | - | - | + | - |
5. | Pro-Arg-Pro-Gly-Pro | + | +
| +
| +
| - | +
| + | - | - | + | - |
6. | Arg-Pro-Gly-Pro | - | +
| +
| +
| - | +
| +/- | - | +/- | + | - |
7. | Pro-Gly-Pro | - | +
| +
| +
| +/- | +
| - | + | - | - | - |
8. | Thr-Lys | + | + | + | + | - | - | + | - | - | - | - |
9. | Thr-Lys-Pro | + | + | + | + | + | + | + | + | - | + | - |
10. | Thr-Lys-Pro-Arg | + | +
| +
| +
| +/- | +
| +
| - | + | - | - |
11. | Lys-Pro-Arg | + | + | + | + | + | - | + | - | - | + | - |
12. | Arg-Pro | + | -
| - | +
| +/- | +
| - | - | - | + | - |
13. | Gly-Pro | - | + | + | + | + | + | + | - | + | + | - |
14. | Gly-Pro-Gly-Pro | - | - | + | + | +/- | - | - | - | - | + | - |
15. | Gly-Pro-Gly | - | + | - | + | + | + | + | - | + | + | - |
ВПГ2 (контроль) | - | + | - | + | + | - | + | - | + | - | - | |
Введение пептидов через 24 часа после заражения | ||||||||||||
1. | Семакс | + | + | - | + | +/- | + | - | + | - | - | - |
2. | Селанк | + | + | - | + | + | + | + | + | - | + | - |
3. | Thr-Lys-Pro-Gly-Pro | + | + | - | + | +/- | +/- | + | +/- | - | + | - |
4. | Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro | + | + | - | + | - | - | + | + | - | + | - |
5. | Pro-Arg-Pro-Gly-Pro | - | + | + | + | + | + | +/- | + | - | - | - |
6. | Arg-Pro-Gly-Pro | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
7. | Pro-Gly-Pro | - | + | + | + | + | + | + | + | - | + | + |
8. | Thr-Lys | + | + | + | - | + | + | + | - | + | + | - |
9. | Thr-Lys-Pro | - | + | + | + | + | + | + | + | + | + | +/- |
10. | Thr-Lys-Pro-Arg | - | + | + | + | + | - | + | + | + | + | + |
11. | Lys-Pro-Arg | - | + | + | + | + | + | + | - | + | - | + |
12. | Arg-Pro | - | + | + | + | - | + | + | - | + | + | - |
13. | Gly-Pro | - | + | + | + | + | + | - | - | + | + | - |
14. | Gly-Pro-Gly-Pro | + | + | - | + | - | - | + | - | + | + | - |
15. | Gly-Pro-Gly | + | + | + | + | - | - | + | + | + | + | - |
ВПГ2 (контроль) | + | + | - | + | + | + | + | + | - | + | - | |
Клетки | + | - | - | - | + | - | +/- | - | + | - | ||
Таблица 6. Влияние пептидов.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 |
