Особенности иммунного ответа при кожных заболеваниях, ассоциированных с герпетической инфекцией, и разработка подходов к их терапии (стр. 1 )

На правах рукописи

ПОТАПОВА ЛЮДМИЛА АНАТОЛЬЕВНА

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИЕЙ, И РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ К ИХ ТЕРАПИИ

03.02.02 – Вирусология

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА МЕДИЦИНСКИХ НАУК

Москва – 2012 г.

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. » Минздравсоцразвития России и ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. » Минздравсоцразвития Россиии

Научные руководители:

Доктор медицинских наук

Доктор биологических наук

Официальные оппоненты:

Заведующий лаборатории сравнительной

вирусологии с Российским центром по герпесу

ФГБУ «НИИ вирусологии им. »

Минздравсоцразвития России,

доктор медицинских наук, профессор

Заведующий лабораторией естественного

иммунитета ФГБУ «НИИ эпидемиологии

и микробиологии им. »

Минздравсоцразвития России,

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

ФГБУ НИИ вакцин и сывороток им. РАМН

Защита состоится «21» мая 2012 г. в 12.00 часов

на заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии им. » Минздравсоцразвития по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ФГБУ «НИИ вирусологии им. » Минздравсоцразвития.

Автореферат разослан « 19» _апреля___ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Вирус герпеса 8 типа (ВГ-8), или вирус, ассоциированный с саркомой Капоши, был открыт в 1994 году Яном Чангом (Chang et al., 1994). В большинстве развитых стран ВГ-8 не является убиквитарной инфекцией и вероятность его обнаружения в крови здоровых людей для Европы и США составляет 1-3%, а для Японии 0,2% . Исключением среди европейских стран является Италия, где ВГ-8 выявляется в 28% случаев. Более, чем у 50% людей ВГ-8 выявляется в странах центральной Африки, включая Кению и Уганду (Verma et al., 2003). Статистические данные о распространении вируса герпеса 8 типа в Российской Федерации разрозненны и малочисленны (Кадырова, 1999, 2003).

Наиболее распространенной патологией, ассоциированной с ВГ-8, является саркома Капоши (СК), идиопатическая форма которой была впервые описана в 1872 году М. Капоши (Kaposi., 1872). В диагностике СК часто возникают затруднения, так как многие сосудистые новообразования способны симулировать кожные элементы СК. Начальные периоды СК отличаются неясной гистологической картиной и создают трудности в постановке диагноза (Молочков, 2002). Поэтому необходимо оптимизировать диагностику данной инфекции, используя различные подходы и их комбинации. Совершенствование диагностики также целесообразно при оценке рисков трансплантации органов и тканей. Представляется важным тщательно исследовать состояние иммунной системы и, в частности, системы цитокинов у пациентов с СК, так как дефекты иммунной системы у данных пациентов способствуют развитию вирусной инфекции.

Целесообразно также определение особенностей иммунитета, сочетающихся с обнаружением в крови маркеров герпесвируса 8 типа. Это поможет в понимании условий, при которых осуществляется жизнедеятельность ВГ-8, и механизмов его активации.

Исследование новых лекарственных препаратов, в частности их антивирусной активности в отношении герпесвирусной инфекции, позволит расширить арсенал применяемых терапевтических средств. Применение пептидов, в качестве лекарственных препаратов, позволит минимизировать побочные эффекты лечения.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящего исследования заключалась в определении характерных особенностей иммунитета у пациентов с кожными заболеваниями, ассоциированными с герпесвирусной инфекцией и совершенствование критериев подбора лекарственных средств для терапии больных с этой инфекцией.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Провести клинико-иммунологическое обследование здоровых добровольцев и пациентов с кожной патологией, включая идиопатическую саркому Капоши (СК).

2. Провести диагностику семи представителей семейства Herpesviridae – вируса простого герпеса 1, 2 типов (ВПГ1,2), ВГ-6 и ВГ-8, цитомегаловируса (ЦМВ), вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ), вируса Varicella Zoster (ВЗ) у пациентов с СК, кожной патологией и у здоровых лиц и оценить частоту их распространения, используя различные методы, а также определить наличие ДНК ВГ-8 в биоптатах пациентов с СК и здоровых лиц.

3. Провести сравнительный анализ показателей иммунитета и особенностей их изменений при герпетической патологии, вызываемой ВПГ1,2, ЦМВ, ВЭБ, ВГ-6, ВГ-8, ВЗ.

4. Определить изменения в синтезе цитокинов, продуцируемых основными иммунокомпетентными клетками, на уровне транскрипции и продукции у пациентов с саркомой Капоши, другой кожной патологией и у здоровых лиц.

5. Исследовать маркеры апоптоза Fas, Fas Ligand, NF-kB, каспазы 3 и 8 на уровне транскрипции у больных СК, кожной патологией и у здоровых лиц.

6. Провести скрининг in vitro препаратов пептидной природы в отношении ВПГ-инфекции и определить потенциальную возможность их применения.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Установлено, что для оптимальной диагностики инфекции, вызванной ВГ-8, необходима комбинация методов ИФА и ПЦР. Наиболее эффективной является диагностика ДНК ВГ-8 в биоптате из очага саркомы Капоши.

2. Впервые проведено комплексное обследование больных с классической саркомой Капоши, включающее определение семи представителей семейства Herpesviridae и широкого спектра цитокинов методами ИФА и ПЦР с обратной транскрипцией.

3. Впервые определены наиболее характерные особенности синтеза цитокинов у больных с классической саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8, указывающие на активацию моноцитов/макрофагов, Th-2, Treg, и B-лимфоцитов и угнетении Th-1.

4. Впервые показано, что у больных с классической саркомой Капоши наличие IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 коррелирует с пониженными значениями ИФН-α (р=0,01), а наличие ДНК ВГ-8 коррелирует с повышением продукции рецепторного антогониста к ИЛ-1 (р=0,0015).

5. Впервые проведен скрининг 15 новых веществ полипептидной природы, обладющих противовирусной активностью в отношении ВПГ-2, и выработаны новые критерии оценки их эффективности.

Основные положения, выносимые на защиту.

1.Подтверждена выраженная ассоциация между маркерами ВГ-8 и диагнозом саркома Капоши и показано, что использование двух методов определения маркеров ВГ-8 (ПЦР и ИФА) повышает вероятность диагностики данной инфекции в 1,7 раза по сравнению с использованием одного из методов. Применение метода ПЦР для определения ДНК ВГ-8 в биоптатах СК повышает вероятность обнаружения ВГ-8 до 100%.

2.Определена частота обнаружения вирусов семейства Herpesviridae у пациентов с саркомой Капоши: выявлена повышенная частота обнаружения ДНК ВЗ и ВГ-6 в МПК в 1,5 раза по сравнению со здоровыми и в 2-3 раза по сравнению с пациентами с кожной патологией. Показано снижение в 2,5 раза частоты выявления ДНК ВПГ-1,2 в МПК пациентов с саркомой Капоши и кожной патологией по сравнению со здоровыми лицами.

3.У пациентов с КП снижена вероятность обнаружения IgG к ВГ-6 в 1,5 раза по сравнению с другими осбледуемыми, наиболее выраженная у больных с псориазом.

4.Не обнаружено достоверных различий в частоте выявления ДНК ВЭБ и ЦМВ в группах СК, КП и здоровых лиц.

5.Определено основное направление иммунного ответа по гуморальному типу у пациентов с саркомой Капоши, ассоциированной с ВГ-8: по сравнению со здоровыми лицами отмечено повышенние уровней ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, снижение уровня ИЛ-2, продукции ИФН-α, ИФН-γ и чувствительности к препаратам интерферонов I и II типа.

6.Обнаружена корреляция между наличием IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 и снижением количества ИФН-α, а также между выявлением ДНК ВГ-8 в мононуклеарах периферической крови (МПК) и повышенным уровнем рецепторного антогониста к ИЛ-1.

7.В группе пациентов с кожной патологией было обнаружено статистически значимое снижение значений ИЛ-4 и ИЛ-10 по сравнению с больными саркомой Капоши и здоровыми лицами.

8.Усовершенствованы критерии оценки иммуномодулирующего эффекта пептидных препаратов, обладающих антивирусной активностью.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на I Международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (Москва, 2008 г.), на IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (С-Петербург, 2008 г.) и IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009 г.). Материалы были доложены на конференции «Молодых ученых» ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России в апреле 2009 г., на конференции отдела медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. » Минздравсоцразвития России в ноябре 2009 г. и на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. » Минздравсоцразвития России 16 ноября 2010 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 181 литературный источник отечественных и зарубежных авторов, 2 ссылки на интернет-сайты. Диссертация выполнена на 145 листах машинописного текста и содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

По результатам исследования опубликовано 7 научных работ, из них 3 - в перечень журналов ВАК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Пациенты. В гг. в клинике МОНИКИ им. было обследовано 22 пациента 49-82 лет с классической саркомой Капоши, 22 пациента 42-60 лет с кожной патологией, в состав которых входили 10 больных с псориазом, 8 – с вульгарной пузырчаткой, 1 – с узловой почесухой, 3 – с буллезным пемфигоидом. Все пациенты обследовались в отделении дерматовенерологии и дерматоонкологии и получали стандартную терапию. Также в клинике МОНИКИ произвели взятие биопсии у 10 пациентов с классической саркомой Капоши из очага саркомы и у 10 здоровых добровольцев из эпидермодермальных слоев кожи. В МЛПУ поселка Софрино Пушкинского района Московской области было обследовано 50 здоровых лиц 18-60 лет. Также была исследована кровь 60 пациентов с генитальным герпесом на базе клиники ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ: диагноз был подтвержден на основании серологического исследования методом иммунофлюоресцентного анализа на наличие антител IgM и IgG к ВПГ 2 типа.

Культуры клеток:

В работе были использованы культуры клеток почек зеленой мартышки Vero и фибробластов эмбриона человека (ФЭЧ), выращенные в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. Все клеточные культуры были получены из музея клеточных культур ФГБУ НИИ вирусологии им. Минздравсоцразвития России.

Вирусы:

Вирусы были получены из музея вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Минздравсоцразвития России.

1.Вирус болезни Ньюкасла (ВБН);

2.Вирус энцефаломиокардита мышей (ВЭМК), штамм «Колумбия SK-Col-SK»;

3.Вирус простого герпеса 2 серотипа, штамм EC.

Пептиды:

Thr-lys-pro-arg-pro-gly-pro (селанк) - №1

Met-glu-his-phe-pro-gly-pro (семакс) - №2

Thr-lys-progly-pro - №3

-----lys-pro-arg-pro-gly-pro - №4

pro-arg-pro-gly-pro - №5

---arg-pro-gly-pro - №6

pro-gly-pro - №7

Thr-lys-- - №8

Thr-lys-pro - №9

Thr-lys-pro-arg--- - №10

-----lys-pro-arg-- - №11

---arg-pro - №12

--gly-pro - №13

Gly-pro-gly - №14

Gly-pro-gly-pro - №15

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Определение ДНК герпесвирусов в МПК осуществлялось с использованием наборов фирмы ДНК-Технология». Исследования проводились согласно инструкции фирмы производителя. Чувствительность определения ДНК составляла 10 копий/мл. В реакцию брали 5 мкл образца.

Электрофорез кДНК проводили в 1% агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл) в Трис-ацетатном буфере, содержащем 0,2 М ЭДТА в горизонтальных камерах фирмы «Bio-Rad» 35 минут.

Фотографировали результаты на цифровую камеру Gel Imager-2 (Хеликон) под мягким ультрафиолетовым освещением 360 нм.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). РНК цитокинов выделяли методом кислой гуанидин тиоционат-фенол-хлороформной экстракции по методике P. Chromczynski и N. Cacchi (Chromczynski et al., 1987). Обратная транскрипция и ПЦР выполнялись по методу Gelder (Gelder et al., 1995). Для проведения ПЦР использовались следующие праймеры: ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ, ГАДФ (праймеры были любезно предоставлены к. б.н. , лаборатория биотехнологии ФГБУ НИИ вирусологии им. Минздравсоцразвития России), ИЛ-6, ИЛ-8 (Lyn et al., 1998), ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-10 (Yamamura et al., 1991), ИЛ-18 (Gaede et al., 1999), ИЛ-12 (Harrison et al., 1996), NF-kB (Bazzoni et al., 2009), ФНО-α, Fas, FasLigand, Casp8 и Casp3 (htpp://medgen.ugent.be/rtprimerdb/).

Определение антител. Определение антител класса IgM к вирусам ВПГ1,2, ЦМВ, ВЭБ, ВЗ и IgG к вирусам ВПГ1,2, ВГ-6, ВГ-8, ЦМВ, ВЭБ, ВЗ в сыворотке крови осуществлялось с использованием тест-системам фирмы -Бест» согласно протоколу производителя.

Определение цитокинов метотодом ИФА. Определение цитокинов в своротке крови осуществлялось с помощью тест-системам фирмы -Бест» согласно протоколу производителя.

Интерфероновый статус. Для исследования использовали гепаринизированную кровь, собранную из локтевой вены обследуемых.

Исследование интерферонового статуса проводили по стандартной методике ( и соавт. 1Исследование включало в себя определение следующих показателей:

1. Уровня циркулирующего интерферона в плазме крови.

2. Уровня спонтанно продуцируемого клетками крови интерферона.

3. Продукции ИФН-α, индуцируемой вирусом болезни Ньюкасла.

4. Продукции ИФН-γ, индуцируемой стандартным митогеном (фитогемагглютинин – ФГА).

5. Уровня чувствительности к препаратам ИФН-α ( с использованием прайминг-эффекта).

6. Уровня чувствительности к препарату ИФН-γ (с использованием прайминг-эффекта).

7. Уровня чувствительности к индукторам ИФН – ридостину, циклоферону, амиксину, неовиру, полиоксидонию, иммуналу и ликопиду.

Определение проводили в трехкратных повторах в 96-луночных плоскодонных планшетах фирмы Costar, в которые вносили кровь, разведенную в 10 раз в среде RPMI-1640 (с глютамином и антибиотиками). Планшеты инкубировали 24 часа в СО2-инкубаторе при 37°. Оставшуюся кровь центрифугировали и полученную плазму использовали для определения циркулирующего интерферона. Через 24 часа биологическим методом определяли активность в каждой пробе с помощью титрования.

Для титрования использовали культуру клеток ФЭЧ, выращенную в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. В качестве индикаторного вируса использовался ВЭМК.

За единицу активности итерферона (Ед/мл) принималась величина, обратная его максимальному разведению, которая защищает 50% клеток от цитопатического действия 100 ТЦД50 вируса.

Определение лейкоцитов в крови. 20 мкл крови разбавляли в 400 мкл 4% уксусной кислоты. После лизиса эритроцитов подсчет лейкоцитов проводился в камере Горяева.

Подсчет лейкоформулы. Высушенный мазок крови окрашивали азур-эозином. Подсчет лейкоформулы осуществляли под световым микроскопом Биомед-4 (Россия).

Исследование потивовирусной активности пептидов и м-РНК цитокинов в клетках VERO.

Титрование ВПГ-2 и тестирование препаратов проводили в 48-луночных планшетах Costar при температуре 37°С во влажной камере в СО2-инкубаторе. Результаты учитывали по цитопатическому эффекту (ЦПД) через 3-4 суток на пике ЦПД.

Лечебные препараты испытывали на клетках почек зеленой мартышки Vero при введении их совместно с вирусом и через 24 часа после заражения. Пептиды были условно обозначены по номерам: №1 – №15. Для сравнения использовали ридостин (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия).

Пептиды были взяты в дозах 10-6 М. Тестирование проводили трехкратно. Клетки Vero заражали средне-высокой инфицирующей дозой вируса – 0,001 ТЦД/клетку.

Через 72 часа после заражения при максимальном развитии ЦПД вируссодержащую культуральную жидкость собирали для дальнейшего определения инфекционных титров вируса. Об уровне противовирусной активности веществ судили по их способности ингибировать ЦПД вируса и результатам титрования проб на клетках VERO на основании снижения титра вируса в опыте по-сравнению с контролем – вирус без препаратов.

Для определения м-РНК цитокинов использовали те же клетки VERO через 48 часов после заражения, в качестве контроля применяли клетки VERO, выращенные в ростовой среде и клетки VERO, зараженные вирусом без добавления препарата.

Определение противовирусной активности пептидов в крови пациентов с генитальным герпесом.

Потенциальный профилактический и терапевтический эффект пептидов в клетках крови пациентов с генитальным герпесом проводили с помощью метода расширенного интерферонового статуса согласно методике и соавт., 2005. Определение проводили трехкратно в плоскодонных планшетах, в которые вносили 0,1 мл крови, разведенной в 10 раз в среде RPMI-1640 (с глютамином и антибиотиками) и пептиды в концентрации 10-5/мл. Планшеты инкубировали 24 часа в СО2-инкубаторе. Через 24 часа биологическим методом определяли активность препарата в каждой пробе с помощью титрования. Для титрования использовали культуру клеток ФЭЧ, выращенных в ростовой среде ИГЛА до образования монослоя. В качестве индикаторного вируса использовался ВЭМК.

Эффект препаратов оценивали по его способности предотвращать развитие ЦПД в монослое клеток при заражении 100 ТЦД50 вируса. В качестве референс препаратов использовали ридостин и циклоферон, в качестве контроля – супернатант инкубированных в среде ИГЛА клеток крови без добавления препарата.

Определение мРНК цитокинов в МПК обработанных пептидами.

МПК пациентов с генитальным герпесом и здоровых лиц в количестве 106 клеток разводили в 1 мл среды RPMI-1640 (с глютамином и антибиотиками) с добавлением 10-6 М препарата. Пробы инкубировали при 37°С 24 часа в СО2-инкубаторе. После этого МПК дважды отмывали 0,9% NaCl и лизировали буфером с гуанидинизотиоционатом. Полученные пробы исследовали на наличие мРНК цитокинов.

Обработка данных. Обработка результатов исследования проводилась в программах «Statistika 6» и «Statistika 9». Для оценки данных использовали критерии Хи-квадрат Пирсона, Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса (ККУ) и Медианный тест (МТ).

При обработке результатов исследования уровня синтеза цитокинов методом ИФА анализируемые совокупности характеризовались, как непараметрические данные с мультимодальным распределением. Кроме того, группы здоровых, СК и КП – являются малыми (n<30). Поэтому для оценки трех групп сравнения применялся дисперсионный анализ с использованием критерия Краскелла-Уоллиса (ККУ) и медианный тест (МТ), а в случае ИЛ-6 и ФНО-α, где оценивались только две группы – СК и здоровых лиц, использовался критерий Манна-Уитни. Для сравнения применялись медианные значения. Для оценки экспрессии цитокинов методом ОТ-ПЦР, и оценки распределения вирусных маркеров использовался китерий Хи-квадрат Пирсона.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

В ходе проведенных исследований было показано (Табл. 1), что у больных с классической (идиопатической) саркомой Капоши (СК) антитела класса IgG к малому капсидному протеину ВГ-8 в сыворотке крови выявлялись в 45% случаев (10 из 22), а в группе пациентов с кожной патологией (КП) и у здоровых лиц антитела к ВГ-8 не были выявлены (р<0,000001). ДНК ВГ-8 в МПК обследованых также определялась у 45% пациентов с саркомой Капоши, что достоверно выше (р=0,000004), чем в группе кожной патологии (9%) и у здоровых лиц (2%). Применение одновременно двух методов ИФА и ПЦР повысило эффективность выявления маркеров ВГ-8 у пациентов с СК до 77%, что достоверно выше (р<0,000001), чем у пациентов с КП (9%) и здоровых лиц (2%). При исследовании 10 образцов биоптатов из очага саркомы и 10 кожных биоптатов здоровых добровольцев методом ПЦР было отмечено, что ДНК ВГ-8 выявлялась в 100% биоптатов пациентов с СК и не выявлялась у здоровых.

Полученные данные позволяют сделать вывод, что для наиболее оптимальной диагностики маркеров ВГ-8 необходимо комбинировать, как минимум 2 метода.

Недостаточная эффективность (45%) серологического метода может объясняться тем, что в основу используемой тест-системы (НПО «Вектор», Новосибирск, Россия) взята С-концевая часть малого капсидного протеина, полученного рекомбинатным путем. Это означает, что эпитопы рекомбинантного протеина не идентичны эпитопам природного белка, который к тому же имеет больший размер. Нельзя исключать того факта, что данный белок может быть недостаточно иммуногенным для некоторых людей.

Кажущаяся малая эффективность метода ПЦР при определении ДНК ВГ-8 может объясняться малыми титрами вируса в сыворотке крови и недостаточной чувствительностью тест-системы.

Наиболее эффективной оказалась детекция ДНК вируса в биоптатах из очага саркомы, но взятие биопсии не всегда рекомендовано.

Выявление маркеров вирусов герпеса у больных с СК, КП и здоровых лиц.

Таблица 1. Маркеры герпесвирусов (Р – уровень значимости).

Группы/ вирусы	ВГ-8	ВГ-6	ВПГ 1,2	ВЗ
Маркеры вирусов	IgG	ДНК	IgG	ДНК	IgG	IgM	ДНК	IgG	IgM	ДНК
Саркома Капоши (n=22)	45,5 %	45,5 %	95,45%	68,2%	100%	0%	18,2%	81,8%	0%	81,8%
Кожная Патология (n=22)	0%	9%	63,6%	50%	100%	0%	18,2%	63,6%	0%	27,3%
Здоровые (n=50)	0%	2%	96%	36%	92%	4%	46%	64%	2%	50%
Р=	<0,01	<0,01	<0,01	0,039	0,16	0,41	0,02	0,29	0,64	0,001

Необходимость выявления маркеров ВГ-8 обоснована в тех случаях, когда имеются трудности в дифференциальной диагностике с другими сосудистыми опухолями и ранними этапами развития СК, так как доказано, что ВГ-8 обнаруживают в ткани саркомы Капоши почти в 100% случаев (Ablashi D., 2002).