Руководство по лабораторной диагностике туберкулеза (стр. 14 )

4.5. Окраска мазков флуорохромными красителями

4.5.1. Общие положения

Флуоресцентная микроскопия — оптическое исследование объектов, окрашенных специальными красителями (флуорохромами), испускающими свечение при воздействии ультрафиолетовыми лучами.

Флуорохромные красители (аурамин О, родамин С и др.) связываются с воскоподобными структурами бактериальных клеток, которые при облучении ультрафиолетовыми лучами видны как флюоресцирующие палочки желтого или оранжевого цвета на темном фоне.

Преимущество флуоресцентного метода микроскопии заключается в возможности просмотра большей площади мазка, что связано с использованием объектива с меньшим увеличением.

Аурамин обладает канцерогенной активностью, поэтому не следует допускать попадания на кожу его порошка или раствора. Взвешивать аурамин нужно, надев виниловые перчатки или 2 пары обычных перчаток и защитные очки. Для защиты дыхательной системы рекомендуется использование респиратора. Помещение после взвешивания следует проветривать. Готовить раствор и проводить окраску мазков следует только в вытяжном шкафу.

При окраске мазков флуорохромными красителями необходимо:

- избегать неполного обесцвечивания;

- готовить достаточно тонкие мазки, поскольку излишняя толщина мазка препятствует качественному обесцвечиванию, а дополнительное докрашивание может скрыть наличие микобактерий. Кроме этого, толстые мазки плохо фиксируются на предметном стекле, в силу чего могут быть смыты в процессе окрашивания;

- избегать чрезмерно интенсивного докрашивания, скрывающего наличие микобактерий.

Так как со временем флуоресцентная окраска может поблекнуть, микроскопию производят по возможности сразу же после окончания процедуры окраски и высыхания мазков. В случае невозможности проведения микроскопии непосредственно после окрашивания, допускается хранение окрашенных мазков в темном месте, желательно, в холодильнике не более 24 часов.

4.5.2. Приготовление реактивов

Реактивы:

1.  Окрашивающий раствор

Раствор 1. Спиртовой раствор аурамина О:

Аурамин 0,1г

Этиловый спирт 96° 10 мл

Растворяют аурамин в спирте.

Раствор 2. Раствор фенола:

Фенол кристаллический 3,0 г

Дистиллированная вода 87 мл

Кристаллы фенола (температура плавления 41°С) растворяют в дистиллированной воде, подогревая на водяной бане.

Рабочий раствор:

В вытяжном шкафу смешивают растворы 1 и 2, переливают в плотно закрывающуюся емкость из темного стекла. Указывают на этикетке название реактива, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в емкости из темного стекла в прохладном затемненном месте в течение 3 месяцев. В процессе хранения раствор может стать мутным, однако это не влияет на качество окрашивания.

2.  Обесцвечивающий раствор (раствор 0,5% солянокислого спирта):

Концентрированная соляная кислота 0,5 г

Этиловый спирт 96° 100 мл

Аккуратно добавляют концентрированную соляную кислоту в этиловый спирт. Следует осторожно влить кислоту в спирт, но не наоборот. Указывают на этикетке название реактива, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в емкости из темного стекла при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

3.  Докрашивающий раствор

Для докрашивания можно использовать растворы перманганата калия, акридинового оранжевого или метиленового синего:

Раствор перманганата калия:

Перманганат калия (КMnО4) 0,5г

Дистиллированная вода 100 мл

Растворяют перманганат калия в дистиллированной воде и переливают в плотно закрывающуюся бутыль из темного стекла. Указывают на этикетке название реактива, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в емкости из темного стекла при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Раствор акридинового оранжевого:

Безводный двузамещенный фосфат натрия (Na2HPO4) 0,01 г

Акридиновый оранжевый 0,01 г

Дистиллированная вода 100 мл

Растворяют фосфат натрия в дистиллированной воде. Добавляют акридиновый оранжевый. Указывают на этикетке название реактива, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в емкости из темного стекла при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Раствор метиленового синего:

Метиленовый синий хлорид 25 мг;

Вода дистиллированная 100 мл.

25 мг метиленового синего хлорида растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Указывают на этикетке название реактива, дату приготовления и срок хранения. Раствор можно хранить в емкости из темного стекла при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

4.5.3. Процедура окраски

Промаркированные и зафиксированные мазки помещают на подставку («рельсы») так, чтобы они не касались друг друга. Не следует окрашивать одновременно более 12 стекол.

На каждое стекло наливают через воронку с бумажным фильтром окрашивающий раствор на 15-20 минут. Не следует подогревать мазки и пользоваться полосками фильтровальной бумаги.

Промывают мазок дистиллированной водой. Водопроводная вода содержит соединения хлора, которые могут повлиять на флюоресценцию.

На стекло наливают обесцвечивающий раствор, оставляют на 2 минуты.

Промывают мазок дистиллированной водой.

Обесцвеченный мазок докрашивают раствором перманганата калия, акридинового оранжевого или метиленового синего с использованием воронки с бумажным фильтром в течение 2 минут.

Промывают мазок дистиллированной водой.

Оставляют препарат на воздухе при комнатной температуре в вертикальном или наклонном положении для высыхания. Не следует промокать препарат. Возможно высушивание мазков в сухожаровом шкафу малого объема при 110оС в течение 10 минут.

При использовании перманганата калия время его воздействия не должно превышать 2 минуты. Точность экспозиции имеет решающее значение, так как при превышении времени экспозиции интенсивность флуоресценции может уменьшаться.

4.5.4. Учет результатов при окрашивании флуорохромными красителями

Учет результатов микроскопического исследования при окраске флуорохромными красителями осуществляется при значительно меньшем увеличении (обычно 400х), чем увеличение, используемое для просмотра мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену (1000х). Поэтому поле зрения, просматриваемое под люминесцентным микроскопом, имеет значительно большую площадь, чем поле зрения светового микроскопа. Следовательно, количество КУБ в 100 полях зрения препарата, окрашенного флуорохромами и просмотренного при увеличении в 400 раз, будет значительно выше, чем при исследовании этого же препарата, окрашенного по Цилю-Нильсену и просмотренного при увеличении в 1000 раз.

При микроскопировании препарата, окрашенного флуорохромными красителями, следует просматривать не менее 40 полей зрения. Просмотренная площадь мазка при микроскопии 40 полей зрения с увеличением х400 равна площади 100 полей зрения с увеличением х1000, или одной линии мазка, равной 2 см.

Регистрация результатов с указанием количества обнаруженных КУБ проводится в соответствии с таблицей 4.2.

Таблица 4.2 - Градация результатов микроскопического исследования при окраске флуорохромами

Количество кислотоустойчивых бактерий (КУБ)	Минимальное число полей зрения, обязательных для просмотра	Форма записи результатов	Интерпретация результатов исследования
КУБ не обнаружены	40	Отр.	Отрицательный
От 1 до 99 КУБ в 40 полях зрения	40	Указать точное количество (1-9 КУБ в 40 п/з)	Положительный
От 20 до 199 КУБ в 40 полях зрения	40	1+	Положительный
От 5 до 50 КУБ в 1 поле зрения	5	2+	Положительный
Более 50 КУБ в 1 поле зрения	5	3+	Положительный

4.6. Внутренний контроль качества микроскопического исследования на КУБ

4.6.1. Внутренний контроль качества микроскопического исследования

Внутренний контроль качества микроскопического исследования проводится при окрашивании каждой партии мазков.

С этой целью исследуются контрольные (заведомо положительные и отрицательные мазки), которые готовят заранее, фиксируют и хранят в закрытом контейнере.

Для подготовки контрольных мазков желательно использовать настоящие пробы мокроты, однако допустимо добавлять к пробам мокроты суспензию микобактерий туберкулеза (для положительных мазков) или кишечной палочки или других некислотоустойчивых палочек (для отрицательных мазков).

Из каждого образца мокроты готовят по крайней мере по 20 мазков, максимально идентичных по размеру и толщине, маркируя каждую серию мазков одним и тем же идентификационным номером. Мазки окрашивают, просматривают 2-3 мазка из каждой серии, отмечают среднее количество КУБ для КУБ+ мазков в журнале контроля качества.

Включают положительные и отрицательные контрольные мазки в каждую партию окрашиваемых мазков. Микроскопию контрольных мазков следует проводить перед микроскопией мазков от пациентов.

Исследуют контрольные мазки, отмечают результаты в журнале контроля качества, регистрируя номер партии красителя и/или дату приготовления раствора.

Неудовлетворительными результатами контроля являются следующие:

1. микроскопическое исследование по Цилю-Нильсену:

- в положительном контрольном мазке КУБ окрашены неярко или их количество слишком мало;

- фон положительного контрольного мазка остается красным;

- в отрицательном контрольном мазке обнаруживаются КУБ;

- в мазках присутствуют конгломераты красителя.

2. микроскопическое исследование с окраской флуорохромами:

- в положительном контрольном мазке КУБ окрашены в неяркий желтый цвет или их количество слишком мало;

- фон отрицательного контрольного мазка остается ярко-желтым после обесцвечивания;

- фон слишком темный или содержит слишком много флуоресцирующих артефактов;