Руководство по лабораторной диагностике туберкулеза (стр. 28 )

Раствор 2 (хранение). К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация капреомицина в полученном растворе составляет 415 мкг/мл. Для приготовления раствора 2 можно использовать весь объем раствора 1.

Раствор 2 аликвотируют по 0,6 мл в криопробирки, промаркированные названием СМ и датой приготовления. Хранят при температуре -20оС в течение 6 месяцев. Возможно только однократное размораживание. После размораживания раствор используют сразу, хранение размороженных растворов не допускается.

Раствор 3 (рабочий). Для проведения исследования раствор 2 оттаивают. К 0,5 мл раствора 2 добавляют 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация капреомицина в полученном растворе составляет 207,5.

Для проведения исследования 100 мкл рабочего разведения капреомицина добавляют в пробирку, содержащую 7,8 мл среды Middlebrook. Концентрация капреомицина в среде составляет 2,5 мкг/мл.

Канамицин

Перед приготовлением рабочего раствора необходимо уточнить содержание действующего вещества в химически чистом веществе ПТЛС и рассчитать необходимую навеску и объем растворителя.

Раствор 1. Навеску химически чистого вещества канамицина, содержащую 41,5 мг (41 500 мкг) действующего вещества, растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация канамицина в полученном растворе составляет 4 150 мкг/мл.

Раствор 2 (хранение). К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация канамицина в полученном растворе составляет 415 мкг/мл. Для приготовления раствора 2 можно использовать весь объем раствора 1.

Раствор 2 аликвотируют по 0,6 мл в криопробирки, промаркированные названием КМ и датой приготовления. Хранят при температуре -20оС в течение 6 месяцев. Возможно только однократное размораживание. После размораживания раствор используют сразу, хранение размороженных растворов не допускается.

Раствор 3 (рабочий). Для проведения исследования раствор 2 оттаивают. К 0,5 мл раствора 2 добавляют 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация канамицина в полученном растворе составляет 207,5.

Для проведения исследования 100 мкл рабочего разведения канамицина добавляют в пробирку, содержащую 7,8 мл среды Middlebrook. Концентрация канамицина в среде составляет 2,5 мкг/мл.

Моксифлоксацин

Перед приготовлением рабочего раствора необходимо уточнить содержание действующего вещества в химически чистом веществе ПТЛС и рассчитать необходимую навеску и объем растворителя.

Раствор 1 (0,1N NaOH). 0,4 г NaOH растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды.

Раствор 2. Навеску химически чистого вещества моксифлоксацина, содержащую 41,5 мг (41 500 мкг) действующего вещества, растворяют в 10 мл 0,1 N NaOH. Концентрация моксифлоксацина в полученном растворе составляет 4 150 мкг/мл.

Раствор 3. К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл 0,1 N NaOH. Концентрация моксифлоксацина в полученном растворе составляет 415 мкг/мл.

Раствор 4 (хранение). К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл 0,1 N NaOH. Концентрация моксифлоксацина в полученном растворе составляет 41,5 мкг/мл. Для приготовления раствора 4 можно использовать весь объем раствора 3.

Раствор 4 аликвотируют по 0,6 мл в криопробирки, промаркированные названием МFX и датой приготовления. Хранят при температуре -20оС в течение 6 месяцев. Возможно только однократное размораживание. После размораживания раствор используют сразу, хранение размороженных растворов не допускается.

Раствор 5 (рабочий). Для проведения исследования раствор 2 оттаивают. К 0,5 мл раствора 2 добавляют 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация моксифлоксацина в полученном растворе составляет 20,75.

Для проведения исследования 100 мкл рабочего разведения моксифлоксацина добавляют в пробирку, содержащую 7,8 мл среды Middlebrook. Концентрация моксифлоксацина в среде составляет 0,25 мкг/мл.

Процедура

Исследование проводят в соответствии с инструкцией к автоматизированной системе (определение чувствительности МБТ к ПТЛС 1 ряда (SIRE)).

Соблюдение правильного порядка пробирок в держателе AST является необходимым условием для надлежащего выполнения тестирования. Порядок пробирок в держателе AST должен всегда быть единообразным. Пробирка контроля роста всегда должна находиться слева от всех пробирок набора.

При подготовке наборов пробирок AST необходимо использовать держатель пробирок, размер которого соответствует тестируемому набору AST. Число пробирок в наборе кодируется в штрих-коде держателя. Использование держателя неправильного размера может привести к тому, что прибор интерпретирует отсутствие пробирки как состояние ошибки, и вследствие этого результаты для всего набора AST будут признаны недействительными.

Набор комбинаций ПТЛС 2 ряда не запрограммирован в системе. Для предотвращения путаницы с результатами ТЛЧ к ПТЛС 1 ряда (SIRE) необходимо выбрать другую комбинацию ПТЛC для распечатки результатов тестирования, например:

Growth Control

Streptomycin

Streptomycin

Ethambutol

Ethambutol.

Не следует выбирать Undefined Drug вместо названия ПТЛС. В этом случае прибор определит только уровень Growth Unit (единица роста), но не интерпретирует результат исследования в данной пробирке как чувствительность (S) или устойчивость (R) к данному ПТЛС.

Для установки наборов пробирок AST в прибор открывают нужную секцию, нажимают программную клавишу «Загрузка пробирки»:

Сканируют этикетку держателя AST со штрихкодом. На экране отображается набор держателя по умолчанию. Поскольку вводимый набор AST не является набором по умолчанию, нажимают программную клавишу «Изменить определение набора AST»:

Используют клавишу СТРЕЛКА ВВЕРХ или СТРЕЛКА ВНИЗ для прокрутки доступных определений для отсканированного размера держателя. Нажимают программную клавишу «ОК» для выбора выделенного набора.

Устанавливают держатель AST в ячейки, обозначенные включенными зелеными индикаторами.

После завершения исследования и распечатки результатов вписывают названия ПТЛС 2 ряда в распечатанный протокол исследования. В таком же порядке результаты исследования для ПТЛС 2 ряда регистрируют в журнале.

При интерпретации результатов определения лекарственной чувствительности МБТ у пациентов в случае несовпадения данных, полученных с использованием автоматизированных систем и метода абсолютных концентраций, принимают во внимание результаты обоих методов. В данном случае рекомендуется проведение повторного тестирования.

10.4.  Внутренний контроль качества определения лекарственной чувствительности микобактерий с использованием автоматизированной системы

В качестве референс-штамма для ТЛЧ с использованием автоматизированной системы рекомендуется использовать штамм М. tuberculosis H37Rv ATCC 27294. Если данный штамм недоступен, можно использовать хорошо изученный клинический изолят М. tuberculosis, чувствительный ко всем тестируемым ПТЛС.

Внутренний контроль качества проводится для каждой новой партии раствора ПТЛС 2 ряда, нового лота SIRE или PZA, среды Middlebrook или PZA в пробирке MGIT.

Если прибор интерпретирует результат исследования в пробирках, содержащих ПТЛС, как чувствительность (S), то результаты контроля качества считаются удовлетворительными.

Если прибор интерпретирует результат исследования в одной или нескольких пробирках, содержащих ПТЛС, как устойчивость (R), то результаты контроля качества считаются неудовлетворительными. В этом случае необходимо повторить исследование с использованием контрольного штамма, в случае повторного неудовлетворительного результата провести повторное определение лекарственной чувствительности всех штаммов МБТ с использованием нового лота SIRE или PZA, среды Middlebrook или PZA в пробирке MGIT. Вся партия замороженного раствора ПТЛС должна быть заменена свежеприготовленным раствором.

Процедура

Рассевают референс-штамм в несколько пробирок с плотной питательной средой, инкубируют при 37±1ºC. Когда в пробирках появится хороший сливающийся рост колоний, пробирки используют для приготовления суспензии.

Используют только свежие культуры микобактерий, выросшие на плотной среде. Если культура является старой (более 10-15 дней), ее пересевают на свежую среду, культивируют 37ºC.

Стерильной лопаткой или бактериологической петлей снимают максимально возможное число колоний, стараясь не захватывать питательную среду, поскольку она увеличивает мутность суспензии. Колонии переносят в стерильную пробирку 1 и растирают стерильной стеклянной палочкой на ее стенках, не касаясь дна, в течение 1 минуты. Затем в пробирку добавляют 4 мл стерильного физраствора, аккуратно встряхивают несколько раз до получения однородной суспензии. Суспензию оставляют на 20 минут для осаждения крупных конгломератов.

Надосадочную жидкость переносят пипеткой в новую стерильную пробирку 2, стараясь не захватывать осадок, оставляют на 15 минут.

Надосадочную жидкость переносят пипеткой в новую стерильную пробирку 3, стараясь не захватывать осадок. Доводят мутность суспензии до McFarland 0,5, добавляя стерильный физиологический раствор и хорошо перемешивая. Если суспензия слишком мутная, переносят часть суспензии в стерильную пробирку 4 и доводят мутность суспензии до McFarland 0,5, добавляя стерильный физиологический раствор и хорошо перемешивая.

Проводят ТЛЧ с использованием новой партии раствора ПТЛС 2 ряда или нового лота SIRE или PZA в соответствии с инструкцией к автоматизированной системе.

Суспензию референс-штамма (пробирка 2) можно заморозить и хранить как описано в п. 8.9.2.

11. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

11.1. Общие положения

Сроки выявления и идентификации микобактерий при проведении бактериологических исследований достаточно длительные и зависят от количества возбудителя в диагностическом материале. Современные молекулярно-генетические методы позволяют значительно сократить время исследования и с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление микобактерий в различном диагностическом материале, их идентификацию и определение лекарственной чувствительности.