Руководство по лабораторной диагностике туберкулеза (стр. 23 )

Следует убедиться в чистоте исследуемых штаммов, строго соблюдать правила хранения и сроки использования ПНБ.

8.6. Идентификация микобактерий комплекса M. tuberculosis с использованием культуральных и биохимических методов

При идентификации штаммов M. tuberculosis учитываются следующие морфологические, биохимические и культуральные свойства:

– появление видимого роста не ранее 3 недель инкубации сутки инкубирования при 36±1°С.

– наличие колоний характерной морфологии (шероховатые, напоминающие хлебные крошки или цветную капусту) и цвета (кремовые, цвета слоновой кости, никогда не бывают желтыми или оранжевыми);

– отсутствие роста на среде с ПНБ (500 мкг/мл);

– положительный результат ниацинового теста;

– положительный результат нитратредуктазного теста;

– термолабильная каталаза.

Алгоритм идентификации микобактерий с использованием культуральных и биохимических тестов представлен на рис. 8.1.

8.7. Иммунохроматографическая идентификация комплекса M. tuberculosis

Биохимические, иммунологические и молекулярно-биологические исследования микобактерий туберкулеза привели к выявлению нескольких антигенов, которые оказались полезны для разработки более совершенных методов и коммерческих тестов идентификации M. tuberculosis. Микобактерии туберкулезного комплекса (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti), как известно, продуцируют, то есть выделяют в питательную среду, более 30 различных белков, один из преобладающих - MPT64 (MPB64). Было установлено, что нетуберкулезные микобактерии не продуцируют этот белок, таким образом, обнаружение MPT64 (MPB64) в пробе свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к комплексу M. tuberculosis.

Иммунохроматографию можно отнести к группе реакций с мечеными антителами. В реакции используют моноклональные антитела к искомому антигену, адсорбированные на микрочастицах (окрашенный латекс или частицы коллоидного золота), и моноклональные антитела к тому же антигену, иммобилизованные в виде полосы на хроматографической бумаге. Кроме того, в этой реакции имеется внутренний контроль (антивидовые антитела, также закрепленные в виде полосы на хроматографической бумаге).

Тест-системы, основанные на данном принципе, обладают высокой специфичностью. Данный метод может быть использован для быстрой идентификации комплекса микобактерий туберкулеза из жидких и твердых культур.

Подготовленный исследуемый материал (суспензия микобактерий или положительная жидкая культура) в небольшом количестве (100 мкл) вносится в стартовое окно тест-системы. Здесь происходит взаимодействие антигена с антителами, адсорбированными на частицах, и начинается движение образовавшихся комплексов за счет капиллярности бумаги. Дойдя до антител, расположенных на бумаге в окне учета результата, эти комплексы связываются, при этом частицы латекса или коллоидного золота проявляются в виде линии голубого (латекс) или (коричневого) цвета. Наличие полосы в окне учета результата свидетельствует о принадлежности исследуемого штамма к комплексу M. tuberculosis, отсутствие – о принадлежности исследуемого штамма микобактерий к НТМ. Поскольку частицы, нагруженные антителами, берутся в избытке, часть их движется дальше и связывается в окне внутреннего контроля реакции. Полоса в этом окне свидетельствует о правильной работе тест-системы. В случае отсутствия полосы в окне внутреннего контроля реакции результаты интерпретировать нельзя. Интерпретация результатов теста проводится через 15 минут после внесения суспензии микобактерий в стартовое окно.

Выполнять исследования следует в соответствии с инструкцией производителя.

Внутренний контроль качества

Сразу же после получения новой партии тестов должно быть проведено тестирование заведомо положительных и отрицательных проб для того чтобы проверить, не произошло ли повреждение тестов в ходе транспортировки.

Внутренний контроль качества проводится каждый раз при проведении тестирования.

В качестве положительного контроля могут быть использованы:

– музейный штамм H37Rv или клинический изолят M. tuberculosis;

– суспензия 1 мкл (эквивалент 1 петли диаметром 1 мм) колоний M. bovis BCG в 0,2 мл 10 ммоль/л фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 0,1% Твина-80;

– жидкая культура M. bovis BCG (McFarland 1 (3-6 х 107КОЕ/мл)), выращенная в жидкой среде.

Следует иметь в виду, что некоторые штаммы M. bovis BCG (Glaxo, пастеровский, тайский) не экспрессируют MPT64 или MPB64. Поэтому только бразильский, японский (Токио), русский, шведский штаммы M. bovis BCG можно использовать в качестве положительного контроля.

В качестве отрицательного контроля могут быть использованы:

– незасеянная жидкая среда;

– 10 ммоль/л фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий 0,1% Твина-80;

– любая нетуберкулезная микобактерия, например, М. smegmatis или М. gordonae.

8.8. Молекулярно-генетическая идентификация микобактерий

Дифференциацию микобактерий туберкулезного комплекса (M. tuberculosis M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti) и идентификацию НТМ рекомендуется проводить с использованием молекулярно-генетических методов исследования.

Использование молекулярно-генетических методов для идентификации микобактерий основано на гибридизации ДНК исследуемого штамма со специфическими для вида микобактерий ДНК-зондами. Применение молекулярно-генетических методов позволяет проводить идентификацию микобактерий в течение рабочего дня.

Наиболее эффективными признаны молекулярно-генетические методы, основанные на гибридизации с ДНК-зондами (Line Probe Assay, LPA), в частности, GenoType®Mycobacterium CM/AS, GenoType® MTBC, INNO-LiPA MYCOBACTERIA. Технология проведения исследований с использованием этих методов включает следующие этапы:

1.  Выделение ДНК из культур микобактерий.

2.  Полимеразная цепная реакция (ПЦР) для амплификации фрагментов генов микобактерий.

3.  Гибридизация ПЦР-продуктов с ДНК-зондами, иммобилизованными на полоске.

4.  Визуализация результатов гибридизации, при этом определяется принадлежность микобактерий к определенному виду.

Выполнять исследования следует в соответствии с инструкцией производителя.

8.9. Хранение выделенных штаммов микобактерий

8.9.1. Кратковременное хранение

Допускается хранение культуры микобактерий при температуре 2-80С на плотных питательных средах в течение 1 года или при комнатной температуре (не выше 200С) в темном проветриваемом месте до 6 месяцев.

Хранение культур в жидкой питательной среде допускается на срок не более 1 месяца.

8.9.2. Долговременное хранение

Клинические изоляты и референс-штаммы для контроля качества должны быть сохранены/заархивированы в адекватных условиях для сохранения жизнеспособности и специфических характеристик штамма. Чтобы избежать многократного субкультивирования, которое может привести к генетическим изменениям, которые приводят к изменению фенотипических и биологических характеристик штамма, целесообразно замораживать культуры микобактерий, которые могут сохраняться в таких условиях в течение нескольких лет (-20ºС) или десятилетий (-70ºC). Следует иметь в виду, что жизнеспособность микобактерий туберкулеза снижается гораздо быстрее при -20ºС, чем при -70ºC, а также что бóльшая плотность замораживаемой суспензии способствует поддержанию жизнеспособности культуры микобактерий. Штаммы для контроля качества желательно хранить при -70ºC и использовать их в течение одного года, поскольку по истечении этого срока жизнеспособность может значительно уменьшиться.

Среда для замораживания

Используют один из следующих вариантов среды для замораживания:

1.  10% раствор молока, стерилизованный при температуре 110ºC в течение 10 минут (возможно использование сухого молока или коммерческого реагента Skimmed Milk Powder);

2.  жидкая питательная среда с повышенным содержанием глицерина, например, Middlebrook 7H9 с добавкой ADC или триптиказо-соевый бульон, приготовленные согласно инструкции производителя;

3.  5% глицерин в 0,85% растворе NaCl, стерилизованный при температуре 110ºC в течение 10 минут.

Процедура

Используют только свежие культуры микобактерий, выросшие на плотной среде. Если культура является старой (более 3 недель), ее пересевают на свежую среду, культивируют 37ºC. Как только появляется хороший рост, используют эту культуру для замораживания.

Стерильной лопаткой или бактериологической петлей снимают максимально возможное число колоний, стараясь не захватывать питательную среду, и вносят в криопробирку, содержащую 1,5 мл одной из вышеперечисленных сред.

Пробирки маркируют с указанием даты приготовления субкультуры, делают запись в журнале.

9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

9.1. Общие положения

Необходимо тщательно выполнять рекомендации по проведению всех этапов исследования на лекарственную чувствительность МБТ и не вносить в стандартную процедуру никаких модификаций.

Для предотвращения контаминации при выполнении всех этапов исследования следует использовать только стерильные растворы, пробирки, пипетки и т. д.

Точное взвешивание веществ противотуберкулезных лекарственных средств, приготовление их растворов, разведение и добавление в среду, приготовление суспензий МБТ является необходимым условием для получения достоверных результатов исследования.

Для приготовления растворов должны использоваться только качественные (от известных производителей или фармацевтических компаний) химически чистые вещества ПТЛС. Лекарственные формы для определения лекарственной чувствительности микобактерий непригодны.

Химически чистые вещества должны иметь оригинальное название, сведения об активности (содержание действующего вещества в процентах, мкг/мг или IU/mg) и срок годности (expiration date). Производитель должен предоставить сертификаты анализа чистоты субстанций с использованием методов тонкослойной хроматографии или жидкостной хроматографии высокого разрешения (HPLC). Сертификаты анализа (Sertificate of analysis) веществ должны предоставляться при покупке химически чистых веществ ПТЛС. Также их можно получить на сайтах фирм-производителей, указав название вещества, номер по каталогу (CAT NO) и номер лота (LOT NO).