Руководство по лабораторной диагностике туберкулеза (стр. 27 )

Детекцию и определение чувствительности микобактерий туберкулеза к ПТЛС с помощью автоматизированных систем проводят параллельно с традиционными исследованиями диагностического материала на плотных питательных средах.

Проведение исследований с помощью автоматизированных систем должно осуществляться в строгом соответствии с инструкцией производителя.

Доставленный в лабораторию для исследования образец диагностического материала обрабатывают с целью разжижения и деконтаминации в соответствии с инструкцией к автоматизированной системе (обычно с использованием NaLC-NaOH), засевают в жидкую и на плотную питательные среды. Параллельно проводят микроскопическое исследование осадка диагностического материала по Цилю-Нильсену. Засеянные пробирки с плотной средой помещают в термостат, пробирки с жидкой средой устанавливают в прибор.

Результат исследования диагностического материала с помощью автоматизированных систем расценивается как положительный при наличии флуоресценции (в системах с флуориметрической детекцией) или изменении цвета сенсора (в системах с колориметрической детекцией) в пробирке с диагностическим материалом. Поскольку среда, используемая в автоматизированных системах, не является селективной, после получения сообщения о наличии роста в пробирке следует определить наличие роста микобактерий. Обычно рост МБТ проявляется появлением своеобразной "зернистости" или белых хлопьев на дне пробирки, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Сильная мутность среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой. Содержимое из «положительной» пробирки должно быть использовано для приготовления мазков; посева на кровяной агар для контроля контаминации; идентификации и субкультивирования на плотных средах.

Максимальное рекомендованное время инкубации пробирок в приборе ВАСТЕС MGIT 960 — 42 дня. Пробирки, в которых рост микобактерий не зафиксирован прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. При наличии видимого осадка в пробирке, идентифицированной системой как отрицательная, рекомендуется провести бактериоскопическое исследование на КУБ и посев на кровяной агар.

При обнаружении роста КУБ и контаминации в одной и той же «положительной» пробирке рекомендуется провести повторную процедуру деконтаминации и посев в новую пробирку с жидкой питательной средой. При получении отрицательного результата микроскопии на КУБ и отсутствии контаминации в «положительной» пробирке рекомендуется дополнительное инкубирование посева в термостате при 36±1оС. В данном случае необходимо каждые 5-7 суток до получения положительного результата проводить посев среды из пробирки на кровяной агар и готовить мазок для окраски по Цилю-Нильсену. При отсутствии положительного результата до 42 суток выдается заключение об отсутствии роста МБТ.

Различие в составе плотных и жидких питательных сред приводят к расхождению результатов бактериологического исследования с использованием традиционного метода и автоматизированной системы в 5-10% случаев. Тем не менее, результат бактериологического исследования образца диагностического материала расценивается как положительный вне зависимости от того, получен он на плотной или в жидкой среде.

10.2.  Внутренний контроль качества питательной среды для детекции микобактерий с использованием автоматизированной системы

Каждая партия среды должна быть протестирована с использованием референс-штамма. Можно использовать любой доступный референс-штамм или хорошо изученный клинический изолят микобактерий. Предпочтительнее использовать быстрорастущие НТМ (M. fortuitum и др.). При тестировании должен быть обнаружен рост контрольного штамма в течение определенного промежутка времени (табл. 10.1).

Таблица 10.1 – Разведение и время до детекции видимого роста контрольных штаммов в жидкой среде

Вид	Номер штамма	Разведение суспензии McFarland 0,5	Время до детекции роста, сут.
M. tuberculosis	H37Rv	1:500	6 - 10
M. kansasii	DSM 44162 ATCC 12478	1:50 000	6 - 11
M. fortuitum	CCUG 46694	1:5 000	1 - 3

10.3.  Определение лекарственной чувствительности микобактерий с использованием автоматизированной системы

Определение лекарственной чувствительности микобактерий можно проводить с использованием культуры микобактерий в жидкой среде или колоний микобактерий, выросших на плотной питательной среде. Исследование проводят в соответствии с инструкцией к автоматизированной системе.

В настоящее время выпускаются диагностические наборы для автоматизированных систем, позволяющие проводить определение чувствительности микобактерий туберкулеза к пяти основным ПТЛС в следующих концентрациях (мкг/мл): стрептомицин (S) - 1,0; изониазид (I) - 0,1; рифампицин (R) - 1,0; этамбутол (E) - 5,0; пиразинамид (PZA) - 100,0.

Диагностические наборы для автоматизированных систем, позволяющие проводить определение чувствительности микобактерий туберкулеза к ПТЛС резервного ряда, в настоящее время не выпускаются. Поэтому лаборатория должна сама приготовить растворы ПТЛС в рекомендуемых концентрациях.

Расчет навески ПТЛС и объема растворителя проводят как описано в п. 9.4.

Для тестирования лекарственной чувствительности микобактерий в пробирку MGIT с 7,0 мл среды добавляют 0,8 мл добавки MGIT 960 SIRE и вносят 0,5 мл инокулята (суспензии микобактерий). Таким образом, общий объем засеянной среды составляет 8,3 мл. В пробирку вносят 0,1 мл раствора ПТЛС, достигая разбавления ПТЛС 1:83 (0,1 мл объема добавленного ПТЛС не принимается в расчет).

Для исследований на лекарственную чувствительность используют только химически чистые вещества ПТЛС, учитывают содержание активного начала в используемом химически чистом веществе. Критические концентрации ПТЛС резервного ряда, рекомендованные ВОЗ, представлены в таблице 10.2.

Таблица 10.2 - Критические концентрации ПТЛС резервного ряда для ВАСТЕС MGIT 960

ПТЛС	Критическая концентрация для ВАСТЕС MGIT 960, мкг/мл
Офлоксацин (Ofx)	2,0
Левофлоксацин (Lfx)	2,0
Амикацин (Am)	1,0
Капреомицин (Cm)	2,5
Канамицин (Km)	2,5
Моксифлоксацин (Mfx)	0,25

10.3.1. Приготовление рабочих растворов ПТЛС резервного ряда

Офлоксацин (левофлоксацин)

Перед приготовлением рабочего раствора необходимо уточнить содержание действующего вещества в химически чистом веществе ПТЛС и рассчитать необходимую навеску и объем растворителя.

Раствор 1 (0,1N NaOH). 0,4 г NaOH растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды.

Раствор 2. Навеску химически чистого вещества офлоксацина, содержащую 33,2 мг (33 200 мкг) действующего вещества, растворяют в 10 мл 0,1N раствора NaOH. Концентрация офлоксацина в полученном растворе составляет 3 320 мкг/мл.

Раствор 3 (хранение). К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация офлоксацина в полученном растворе составляет 332 мкг/мл. Для приготовления раствора 3 можно использовать весь объем раствора 2.

Раствор 3 аликвотируют по 0,6 мл в криопробирки, промаркированные названием OFX и датой приготовления. Хранят при температуре -20оС в течение 6 месяцев. Возможно только однократное размораживание. После размораживания раствор используют сразу, хранение размороженных растворов не допускается.

Раствор 4 (рабочий). Для проведения исследования раствор 3 оттаивают. К 0,5 мл раствора 3 добавляют 0,5 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация офлоксацина в полученном растворе составляет 166 мкг/мл.

100 мкл рабочего разведения офлоксацина добавляют в пробирку MGIT. Концентрация офлоксацина в среде составляет 2,0 мкг/мл.

Амикацин

Перед приготовлением рабочего раствора необходимо уточнить содержание действующего вещества в химически чистом веществе ПТЛС и рассчитать необходимую навеску и объем растворителя.

Раствор 1. Навеску химически чистого вещества амикацина, содержащую 33,2 мг (33 200 мкг) действующего вещества, растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация амикацина в полученном растворе составляет 3 320 мкг/мл.

Раствор 2 (хранение). К 1 мл раствора 2 добавляют 9 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация амикацина в полученном растворе составляет 332 мкг/мл. Для приготовления раствора 2 можно использовать весь объем раствора 1.

Раствор 2 аликвотируют по 0,6 мл в криопробирки, промаркированные названием АМ и датой приготовления. Хранят при температуре -20оС в течение 6 месяцев. Возможно только однократное размораживание. После размораживания раствор используют сразу, хранение размороженных растворов не допускается.

Раствор 3 (рабочий). Для проведения исследования раствор 2 оттаивают. К 0,5 мл раствора 2 добавляют 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация амикацина в полученном растворе составляет 83 мкг/мл.

Для проведения исследования 100 мкл рабочего разведения амикацина добавляют в пробирку, содержащую 7,8 мл среды Middlebrook. Концентрация амикацина в среде составляет 1,0 мкг/мл.

Капреомицин

Перед приготовлением рабочего раствора необходимо уточнить содержание действующего вещества в химически чистом веществе ПТЛС и рассчитать необходимую навеску и объем растворителя.

Раствор 1. Навеску химически чистого вещества капреомицина, содержащую 41,5 мг (41 500 мкг) действующего вещества, растворяют в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Концентрация капреомицина в полученном растворе составляет 4 150 мкг/мл.