2.1 Операционная техника и подготовка препарата
Для решения поставленных задач было проведено 9 серий экспериментов. Серии отличались используемым покрытием полипропиленового имплантата. В первой серии с целью выявления макроскопических и микроскопических изменений в области фиксации у 20 животных мы использовали полипропиленовый имплантат без покрытия.
В отдельной серии из 20 животных мы использовали композитную сетку с гидрогелевым слоем, произведенную в фабричных условиях. В остальных 7 сериях использовался полипропиленовый имплантат с различными покрытиями.
Распределение животных в зависимости от вида использованного имплантата представлено в таблице 1. Всего в работе было использовано 155 животных.
Анестезия проводилась внутрибрюшинным введением 5% раствора кетамина, из расчета 0.3 мл на 100 грамм веса. Глубокая анестезия наступала через 3-5 мин. и продолжалась в среднем 30 мин.
Таблица 1
Распределение животных по сериям в зависимости от используемого имплантата.
Имплантат | Количество животных |
Полипропиленовый имплантат | 20 |
Полипропиленовый имплантат с фибробластами на коллагеновой пленке | 20 |
Полипропиленовый имплантат с клетками костного мозга на коллагеновой пленке | 20 |
Полипропиленовый имплантат с коллагеном на двух поверхностях | 20 |
Полипропиленовый имплантат с коллагеном на висцеральной поверхности | 20 |
Полипропиленовый имплантат с противоспаечным гелем | 10 |
Полипропиленовый имплантат с твердой мозговой оболочкой | 20 |
Полипропиленовый имплантат с препаратом брюшины | 5 |
Композитная сетка с гидрогелевым слоем | 20 |
Всего | 155 |
Животное фиксировали к хирургической доске в положении лежа на спине, операционное поле выбривали, обрабатывали 1% раствором йодопирона, обкладывали стерильными салфетками, после чего выполняли срединную лапаротомию длиной около 5 см.
Края операционной раны разводили с помощью зажимов и на париетальную брюшину в мезогастральной области полипропиленовыми нитками 6/0 с атравматической иглой отдельными узловыми швами фиксировали имплантат размером 2х2 см (рисунок 1).
| Рисунок 1 Фиксация имплантата на париетальную поверхность брюшины. |
Ушивание лапаротомной раны проводили отдельными узловыми швами полигликолидом 3/0. С целью уменьшения гипотермии и побочных действий наркоза, в период пробуждения животные укладывались на термоматрас и укрывались пеленкой.
Животные выводились из эксперимента путем эвтаназии, через 7, 14, 30 и 180 дней после имплантации. Сроки эвтаназии обусловлены и выбраны как оптимальные для морфологического исследования воспалительного и спаечного процессов. С этой целью животным внутрибрюшинно вводили 50% раствор уретана из расчета 0.3 мл на 100 грамм веса. После констатации смерти животного, выполняли вскрытие. Визуально оценивали степень срастания имплантата с париетальной брюшиной, наличие спаек, степень воспалительных изменений со стороны внутренних органов и передней брюшной стенки. Имплантат иссекали с подлежащими мышцами передней брюшной стенки, для последующего гистологического исследования. Препарат нумеровали и фиксировали 10% раствором формалина, заливали в парафин (изготовление срезов). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином по Ван-Гизону (методика патоморфологических исследований).
Распространенность спаечного процесса оценивалась по классификации О. И. Блинникова (1993 г.).
I степень: локальный спаечный процесс, ограниченный областью рубца.
II степень: локальный спаечный процесс в сочетании с одиночными спайками в других областях.
III степень: спаечный процесс занимает этаж брюшной полости.
IV степень: спаечный процесс занимает 2/3 брюшной полости и более.
Степень срастания имплантата с париетальной брюшиной определялась следующими критериями:
Плотное сращение – исчезает граница между соединительнотканным футляром, сформированным вокруг имплантата, и соединительной ткани париетальной брюшины. При этом формируется прослойка хорошо васкуляризированная, без признаков воспаления с ориентированными коллагеновыми волокнами.
Слабое сращение – истончение соединительнотканной прослойки, с возможным включением в свой состав жировую ткань. Слабое развитие коллагеновых волокон или сохранение реактивной воспалительной реакции на филаменты сетки.
Частичное сращение – контакт между имплантатом и париетальной брюшиной отмечается не по всей площади прилегания.
2.2 Изготовление имплантатов
В качестве основы использовали широко применяемый в открытой герниопластике сетчатый протез из полипропиленовых монофиламентов толщиной нити 0,12 мм, объемной пористостью 85%, поверхностной плотностью 62 г/м2.
Полипропиленовый имплантат с коллагеном с обеих сторон.
При изготовлении полипропиленового имплантата с коллагеном с обеих сторон, в предварительно отмытый крысиный коллаген I типа (рН 7,2) опускали полипропиленовую сетку. Затем ее высушивали в стерильных условиях под ультрафиолетовой лампой в ламинарном шкафу с вертикальной подачей воздуха. Заполнение ячеек сетки коллагеном проверяли микроскопически. При неполном покрытии процедуру повторяли. В дальнейшем было решено не отмывать коллаген, а время высушивания увеличить до 3 часов. Затем имплантат запаковывали в стерильный контейнер. Перед использованием имплантат на 2-3 минуты замачивали в теплом физиологическом растворе.
Полипропиленовый имплантат с фибробластами на коллагеновой пленке.
Полученные из вивария института, крысиные эмбрионы помещали в стерильные флаконы с раствором Хенкса и антибиотиками. В стерильном боксе от эмбрионов отделяли мышечную ткань, которую измельчали до 1 мм3 и заливали 1% раствором коллагеназы. В данном растворе образцы инкубировали при температуре 370С в течение 20 минут и центрифугировали при 800 об/мин в течение 10 минут. Получившийся осадок помещали в 3 культуральных сосуда с ростовой поверхностью 25 см2 и заливали питательной средой 199. Спустя сутки клетки сгруппировывались, образовывая монослой 80%-ной конфлюентности. Формирование плотного монослоя наблюдалось через 48 часов после эксплантации. Впоследствии для пассирования культуры, отбиралась часть клеток и высеивалась в отдельной чашке.
Для изготовления имплантата использовали клетки 3 пассажа. С этой целью на имплантат покрытый коллагеном с обеих сторон высеивали культуру клеток. Затем его высушивали в СО2 - инкубаторе при температуре 37С0 в течение суток. За это время клетки врастали в коллаген, покрывающий поверхность сетки и разрастались по ней.
Полипропиленовый имплантат с клетками костного мозга на коллагеновой пленке.
Для получения культуры клеток костного мозга, из бедренной кости крысы шприцом, содержащим 5 мл питательной среды 199, вымывали костный мозг. Полученную суспензию помещали в культуральные сосуды с ростовой поверхностью 25 см2 и заливали питательной средой 199 с 10% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота. Первичную клеточную взвесь культивировали в СО2 – инкубаторе при температуре 370С до образования монослоя. Клетки пассировали до 7 пассажа дважды в неделю, с коэффициентом рассева 1:2. Клетки 7 пассажа использовали для изготовления имплантата. Процедура нанесения клеток на полипропиленовую сетку аналогична процедуре с фибробластами.
Полипропиленовый имплантат с коллагеном на висцеральной поверхности.
Для изготовления имплантата с коллагеном на висцеральной поверхности, в чашку Петри на карбоксиловую подложку наносили крысиный коллаген I типа. В чашку помещали полипропиленовую сетку, не допуская ее полного погружения. Высушивание и стерилизацию проводили в ламинарном шкафу ультрафиолетовой лампой с вертикальной подачей воздуха в течение суток. Впоследствии имплантат аккуратно отделяли от карбоксиловой подложки. При этом, на начальных этапах работы, часто часть высохшего коллагена оставалась на карбоксиловой подложке, так как при высыхании коллаген прочно прилегал к ней. В дальнейшем с целью устранения этой проблемы, последнюю смазывали тонким слоем стерильного жидкого вазелина. Это предотвращало прилегание коллагена к подложке и облегчало отделение имплантата. Затем имплантат запаковывали в стерильный контейнер. Перед использованием имплантат на 2-3 минуты замачивали в теплом физиологическом растворе.
Полипропиленовый имплантат с противоспаечным гелем.
После срединной лапаротомии и фиксации на париетальную брюшину полипропиленового имплантата, шприцом на висцеральную поверхность имплантата наносили противоспаечный рассасывающийся гель. Лапаратомную рану ушивали отдельными узловыми швами.
Полипропиленовый имплантат с человеческой брюшиной.
После изъятия у донора париетальной брюшины, ее промывали физиологическим раствором и на 30-40 минут помещали в 15% раствор глицерина в жидкости Рингера-Локка с антибиотиками. Затем брюшину помещали в холодильник при температуре -30 -500С. После получения всех результатов обследования, препарат размораживали опусканием в стерильный физиологический раствор при температуре 450С на 10-15 минут. Затем ее извлекали путем обработки 3% раствора перекиси водорода и промывали физиологическим раствором. Впоследствии препарат повторно замораживали при температуре -60 -700С и подвергали сублимационной сушке. После сушки препарат стерилизовали и герметично упаковывали. Перед использованием препарат погружали на 10-15 минут в физиологический раствор комнатной температуры.
Полипропиленовый имплантат с человеческой твердой мозговой оболочкой.
После изъятия твердой мозговой оболочки у донора, ее помещали в емкость со специальным консервирующим раствором при комнатной температуре на 30-40 минут. Впоследствии емкость помещали в холодильник при температуре -800С, до получения данных обследования донора (ВИЧ, RW, HBsAg,, HCV, общий билирубин, пробы на токсичность, бактериологический посев). После получения результатов анализов, препарат размораживали путем погружения в теплый физиологический раствор при температуре 450С и выкраивали ножницами в виде сферы. Полученные лоскуты лиофилизировали при -40 -460С 2 часа и при 34 0С еще 2 часа. Такие биотрансплантаты имели толщину от 0.6 до 0.8 мм. Впоследствии препарат расщепляли с помощью ленточно-двоильной машины KS 520 SE\CE. Двоение проводили следующим образом: с помощью ручного управления устанавливали толщину 0.2-0.4 мм, подача лиофилизированного трансплантата осуществлялась также вручную. Полученный трансплантат стерилизовали и перед применением отмачивали в физиологическом растворе при комнатной температуре.
|
Из за большого объема этот материал размещен на нескольких страницах:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 |
Основные порталы (построено редакторами)