Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 13 )

Количественное определение глюкозы в крови является одним из основных методов диагностики нарушений углеводного обмена.

Клинико-диагностическое значение

Повышение концентрации глюкозы в сыворотке крови (гипергликемия) наблюдается чаще всего при недостаточной секреции инсулина, а также при гиперфункции щитовидной железы и гиперсекреции гормонов, в частности, при опухолях коркового слоя надпочечников и опухолях гипофиза.

Гипогликемия может наблюдаться при гипофункции щитовидной железы, гипофизарной кахексии, Аддисоновой болезни, аденоме поджелудочной железы, а также может быть вызвана голоданием, продолжительной физической работой или передозировкой инсулина.

Цель работы

Определить содержание глюкозы в исследуемой сыворотке крови ферментативным методом и сравнить полученные результаты с нормальными величинами.

Принцип метода

Глюкоза окисляется кислородом воздуха в присутствии высокоспецифичного фермента глюкозооксидазы с образованием пероксида водорода. Затем пероксид водорода в присутствии фермента пероксидазы реагирует с 4-аминоантипирином и фенолом. В результате образуется окрашенное соединение, оптическая плотность которого при 510 нм пропорциональна концентрации глюкозы в анализируемом образце.

Выполнение работы (см. приложение)

Реагенты	Опыт	Стандарт	Контроль
Глюкозный реактив*, мл	3	3	3
Сыворотка крови, мл	0,02	—	—
Стандартный раствор глюкозы (10 ммоль/л), мл	—	0,02	—
Н2О, мл			0,02
Пробы перемешивают и инкубируют 15 мин при температуре 37°С
Фотометрируют против Н2О (l = 510 нм, толщина кюветы 0,5 см). D510
Dоп – Dк

* 4-аминоантипирин, п-гидроксибензолсульфонат, пероксидаза и глюкозооксидаза, фосфатный буфер (pH 8,0)

Расчет содержания глюкозы в сыворотке крови(моль/л):

Норма: для сыворотки и плазмы крови 3,9 – 6,1 ммоль/л, для цельной крови 3,3-5,5 ммоль/л.

Выводы

Б. Определение глюкозы в крови с помощью глюкометра (демонстрация)

Принцип ферментативного определения глюкозы положен в основу многочисленных автоматических глюкометров, которые выпускаются в комплекте с электрохимическими тест-полосками однократного использования.

Определение концентрации глюкозы в крови осуществляют после нанесения пробы крови на полоску, подключенную к прибору. Прибор обнаруживает пробу крови, определяет концентрацию глюкозы и выводит показания на экран. Прибор может применяться в клинической практике при недоступности лабораторных методов измерения, при скрининговых исследованиях, в полевых условиях и чрезвычайных ситуациях, а также для индивидуального использования с целью постояного контроля за уровнем глюкозы в крови у больных сахарным диабнтом.

В. Оральный глюкозотолерантный тест (синонимы: тест толерантности к глюкозе, реакция организма на сахарную нагрузку)

У здорового человека однократный прием 50-100 г глюкозы вызывает временное повышение ее содержания в крови – пищевую или алиментарную гипергликемию. Эта гипергликемия обусловлена тем, что при поступлении сразу большого количества глюкозы печень не успевает утилизировать ее полностью, и часть глюкозы поступает в кровь. Повышение содержания глюкозы в крови вызывает выделение инсулина, который нормализует ее содержание в крови уже через 1,5-2 часа. Обычно выделяется избыточное количество инсулина, и уровень глюкозы опускается даже несколько ниже нормы. При инсулиновой недостаточности содержание глюкозы в крови после нагрузки достигает значительно больших величин и сохраняется значительно дольше.

Цель работы

Познакомиться с методикой проведения теста, построить «сахарные кривые» по предложенным данным и самостоятельно их проанализировать.

Выполнение работы

Предварительно у взрослого пациента определяют содержание глюкозы в крови натощак. Затем он принимает внутрь 75 г глюкозы, растворенной в 250-300 мл воды. Через 30, 60, 90, 120 и 150 мин после приема глюкозы определяют ее содержание в крови, и полученные результаты изображают в виде кривой, где на оси абсцисс откладывают время взятия крови в минутах, а на оси ординат – количество глюкозы, выраженные в ммоль/л. Такие графики традиционно называют «сахарными кривыми»:

На основании приведенных ниже данных (см. таблицу) предлагается построить «сахарные кривые», сравнить их между собой и сделать вывод об инсулиновом статусе пациентов (А, Б и В).

Согласно критериям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) концентрация глюкозы 7,8 – 10,0 ммоль. л-1 в капиллярной цельной крови через 2 часа после нагрузки глюкозой свидетельствует о нарушении толерантности к глюкозе, а выше 11,1 ммоль. л-1 – о сахарном диабете.

Время взятия крови после приема глюкозы (мин)	Количество глюкозы, ммоль. л-1
Пациент А	Пациент Б	Пациент В
0	5,9	4,5	8,0
30	7,0	7,0	11,5
60	9,2	7,5	11,8
90	9,0	5,5	11,5
120	8,0	5,5	11,0
150	7,0	5,0	11,0

Выводы

Тестовые задания по теме:

«Распад и синтез гликогена. Гликолиз и гликогенолиз»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Скорость гликолиза и гликогенолиза контролируется фосфофруктокиназой.

2.  Синтез и распад гликогена в тканях происходят различными путями.

3.  Инсулин активирует фосфорилазу "b".

4.  Гликоген в мышцах рападается с образованием глюкозо-6-фосфата.

5.  Положительный баланс гликогенолиза составляют 2 молекулы АТФ.

6.  Процесс гликолиза обратим.

7.  Необходимо ли фосфорилирование глюкозы для включения ее в обменные процессы?

8.  Все ли ферментативные реакции гликолиза обратимы?

9.  Сопровождается ли процесс анаэробного гликолиза накоплением НАДН(Н+)?

10. Относится ли пируваткиназа к классу гидролаз?

11. Расщепляет ли альдолаза фруктозо-1,6-бисфосфат?

12. Обратима ли лактатдегидрогеназная реакция?

2) Выбрать один правильный ответ:

В опыте с мышечной тканью изучали гликолиз в анаэробных условиях. Скорость гликолиза уменьшается при добавлении: 1.  АДФ 2.  АМФ 3.  цитрата 4.  ацетил-КоА 5.  сукцината

Метаболит гликолиза в эритроцитах, изменяющий сродство гемоглобина к кислороду: 1.  1,3-бисфосфоглицерат 2.  2,3-бисфосфоглицерат 3.  2-фосфоглицерат 4.  3-фосфоглицерат 5.  фосфоенолпируват

3) Установить последовательность образования метаболитов гликолиза

1. 2. 3. 4. 5.

А. фруктозо-1,6-бисфосфат Б. глицеральдегид-3-фосфат В. фруктозо-6-фосфат Г. 1,3-бисфосфоглицерат Д. глюкозо-6-фосфат

4.3. Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче

А. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ: 1.3.99.1) – единственный фермент цикла трикарбоновых кислот Кребса, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий (комплекс II). Коферментом СДГ служит ФАД, акцептирующий два атома водорода от молекулы сукцината и переносящий их непосредственно на коэнзим Q (убихинон) в дыхательной цепи митохондрий. ФАД прочно связан с молекулой СДГ.

Цель работы

Убедиться в способности сукцинатдегидрогеназы мышечной ткани проявлять активность в анаэробных условиях.

Принцип метода

Доказательством проявления активности СДГ может служить изменение окраски искусственного акцептора водорода метиленового синего:

Выполнение работы

Так как восстановленная форма метиленового синего вновь окисляется на воздухе, опыт проводят в анаэробных условиях, предотвращая доступ кислорода наслаиванием на поверхность пробы вазелинового масла. Контролем служит гомогенат мышц, в котором СДГ инактивирована кипячением. Критерием активности СДГ служит время обесцвечивания опытной пробы в присутствии сукцината в анаэробных условиях.

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Гомогенат мышц (мясной фарш), мл	2	2
Нагревают при 100°С в течение 5 минут на водяной бане, а затем охлаждают до комнатной температуры	—	+
0,05 М Фосфатный буфер, рН 6,8, мл	1	1
5 мМ Сукцинат, мл	2	2
Метиленовый синий, 0,05% раствор, капли	2	2
Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой, заливают вазелиновым маслом и инкубируют при комнатной температуре
Окраска
Время обесцвечивания

Выводы