Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 5 )

Реактивы	Проба на белок в диализате	Проба на белок в диализируемой жидкости	Проба на ионы Cl- в диализате
Диализат	10 капель	–	10 капель
Диализируемый раствор	–	10 капель	–
10 % NaOH	5 капель	5 капель	–
1 % CuSO4	1 капля	1 капля	–
10 % HNO3	–	–	1 капля
1 % AgNO3	–	–	1 капля
Наблюдения

Выводы

Б. Хроматография аминокислот

Хроматографический метод, разработанный русским ученым , является одним из относительно простых и быстрых методов разделения смеси веществ.

Существует несколько разновидностей метода в зависимости от принципа разделения смеси на составляющие компоненты (адсорбционная, ионообменная, аффинная хроматография).

Примером адсорбционной хроматографии является распределительная хроматография на бумаге, которая оказалась наиболее доступной для разделения аминокислот, отличающихся гидрофобностью радикалов а также для идентификации неизвестных аминокислот путём сравнения их подвижности со стандартными растворами известных аминокислот.

Цель работы

Провести разделение смеси двух неизвестных аминокислот[§], рассчитать для каждой из них Rf (см. далее) и идентифицировать аминокислоты по сравнению с Rf стандартов (глутаминовая кислота и лейцин).

Принцип метода

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях: в воде, которая удерживается фильтровальной бумагой и является неподвижной фазой растворителя, и в подвижной фазе органического растворителя (бутанол : уксусная кислота : вода, 5 : 1 : 4).

По мере продвижения растворителя по бумаге происходит многократное перераспределение аминокислот между подвижной и неподвижной фазами растворителей. Чем больше гидрофобность аминокислоты, тем быстрее она будет продвигаться по бумаге и наоборот. В соответствии с этим расстояния, которые аминокислоты пройдут с подвижной фазой растворителя по бумаге, будут различными.

Скорость передвижения каждой аминокислоты может быть выражена коэффициентом распределения (Rf). Коэффициентом распределения называют отношение расстояний (в мм) от места нанесения аминокислоты (старта) до середины ее пятна (величина а) к расстоянию от места старта до границы фронта растворителя (величина b). Чем выше гидрофобность аминокислотного радикала, тем ближе к единице будет величина Rf.

Коэффициент распределения для каждой аминокислоты постоянен при стандартных условиях проведения опыта (тип бумаги, температура, тип растворителя, влажность) и служит средством идентификации аминокислот по сравнению со стандартами.

Выполнение работы

Диск хроматографической бумаги (d = 12 см) размечают карандашом (см. рисунок ниже).

В места, отмеченные точками, наносят по 2 мкл образцов стандартных растворов аминокислот (0,6% раствор глутаминовой кислоты и 0,5% раствор лейцина) и смесь неизвестных аминокислот. Высушивают бумажный диск с образцами на воздухе.

Разрезают хроматографический диск по линиям разреза, отгибают по линии сгиба получившуюся ножку и укорачивают ее до длины 3 см. Помещают диск в хроматографическую камеру (чашку Петри) так, чтобы ножка была погружена в органический растворитель.

Когда фронт растворителя пройдет 5 - 6 см, извлекают хроматограмму из камеры и тщательно обводят карандашом образовавшийся фронт растворителя.

Высушивают диск в сушильном шкафу при 60-80°С.

Погружают диск в 0,5% раствор нингидрина в ацетоне и вновь высушивают до проявления пятен аминокислот[**].

Оформление работы:

В рабочей тетради записать ход работы, рассчитать значение Rf для каждой аминокислоты, вклеить полученную хроматограмму или зарисовать её.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Структура и свойства пептидов и белков»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Целостность четвертичной структуры белка важна для проявления его биологической активности.

2.  Кератин не растворим в воде.

3.  Все белки содержат однотипные домены.

4.  Фолдинг белковых молекул начинается с быстрого формирования элементов вторичной структуры.

5.  Природные пептиды могут обладать гормональной активностью.

6.  Применим ли метод диализа для разделения белков с различной молекулярной массой?

7.  Существуют ли белки, не содержащие β-складчатые слои?

8.  Можно ли разделить белки методом бумажной хроматографии?

9.  Вся ли полипептидная цепь белков полностью спирализована?

10. Содержится ли белок в моче здорового человека?

11. Участвуют ли водородные связи в образовании вторичной структуры белка?

12. Относятся ли гистоны к кислым белкам?

2) Выбрать один правильный ответ

Смесь различных белков невозможно разделить методом: ионнообменной хроматографии электрофореза высаливания диализа гель-фильтрации

Шапероны участвуют в образовании: первичной структуры белков первичной структуры нуклеиновых кислот третичной структуры белков третичной структуры нуклеиновых кислот вторичной структуры нуклеиновых кислот

3) Найти соответствие

Характер радикала аминокислот	АМК
Гидрофильный Гидрофобный Амфифильный	А. Лейцин Б. Глицин В. Валин Г. Серин Д. Глутамин

1.5. Коллоквиум I по теме «Аминокислоты и простые белки»

Вопросы, для самостоятельной подготовки

1.  Классификация белков. Химия простых белков. Природные пептиды.

2.  Аминокислотный состав белков. Цветные реакции на белки.

3.  Физико-химические свойства белков. Изоэлектрическая точка растворов белков.

4.  Уровни структурной организации белков: первичная, вторичная третичная и четвертичная структуры белков. Связь структуры белка с биологической функцией.

5.  Аминокислоты: их строение и свойства. Классификация аминокислот. Характер связи аминокислотных остатков в молекуле белка.

6.  Доменная структура белков. Фолдинг белковых молекул. Понятие о шаперонах.

7.  Биологически активные пептиды

Варианты письменной части коллоквиума

1. Написать формулу трипептида. глутамилпролиллизин   I.  аспартиллизилпролин   II.  пролиларгинилглутамат   III.  гистидиллизилсерин 2. Какими методами можно разделить:   I.  альбумины и глобулины?   II.  казеин и продукты его гидролиза?   III.  гис и гли?   IV.  асп и арг? 3. Как можно определить наличие в растворе:   I.  трп?   II.  мет?   III.  глобулинов?   IV.  цис?

4. Привести один пример белка из группы:   I.  протаминов   II.  проламинов   III.  альбуминов   IV.  глобулинов 5. Охарактеризовать структуру белка:   I.  первичную   II.  вторичную   III.  третичную   IV.  четвертичную 6.Дать краткое определение понятия:   I.  пострансляционная модификация белка   II.  фолдинг белковых молекул   III.  олигомерные белки   IV.  шапероны

Варианты заданий на компьютерном тестировании

Инструкция к тесту: выбрать все правильные ответы

1. Незаменимые для человека аминокислоты 1.  фенилаланин 2.  тирозин 3.  триптофан 4.  треонин 5.  метионин 2. Положительным зарядом в радикальной части обладают аминокислоты 1.  аспарагин 2.  глутамин 3.  лизин 4.  глутамат 5.  гистидин 3. Серосодержащие аминокислоты метионин 1.  лизин 2.  валин 3.  цистеин 4.  аргинин 4. Гидрофобные аминокислоты 1.  глутамин 2.  валин 3.  треонин 4.  фенилаланин 5.  изолейцин 5. При денатурации белка не нарушаются связи 1.  дисульфидные 2.  водородные 3.  пептидные 4.  ионные 5.  гидрофобные 6. Донор метильных групп 1.  валин 2.  лейцин 3.  метионин 4.  аргинин 5.  треонин 7. Наибольшая величина Rf при бумажной хроматографии будет для аминокислоты 1.  глицина 2.  треонина 3.  серина 4.  глутамата 5.  валина 8. Изоэлектрическая точка белка зависит от 1.  наличия гидратной оболочки 2.  суммарного заряда аминокислотных радикалов 3.  наличия водородных связей 4.  наличия спиральных участков в молекуле 5.  всех перечисленных параметров 9. Биуретовая реакция будет положительной для 1.  простых белков 2.  дипептидов 3.  трипептидов 4.  раствора аминокислот 5.  желатины 10. Олигомерные белки проходят через полупроницаемую мембрану 1.  не содержат a-спиральных участков 2.  состоят из нескольких полипептидных цепей 3.  не обладают четвертичной структурой 4.  соответствуют всем вышеуказанным утверждениям 11. Гидрофильные аминокислоты 1.  глутамин 2.  серин 3.  аргинин 4.  фенилаланин 5.  аспарагин 12. Аминокислота без стереоизомеров 1.  тирозин 2.  глицин 3.  аланин 4.  цистеин 5.  серин 13. Незаменимые для человека аминокислоты 1.  лизин 2.  треонин 3.  орнитин 4.  валин 5.  цистеин 14. Аминокислоты с незаряженными радикалами 1.  треонин 2.  триптофан 3.  аргинин 4.  гистидин 5.  серин 15. Аминокислоты – производные пропионовой кислоты 1.  аланин 2.  серин 3.  цистеин 4.  треонин 5.  фенилаланин 16. Гидрофобная аминокислота 1.  серин 2.  лейцин 3.  глутамин 4.  цистеин 5.  лизин 17. Денатурацию белка вызывает добавление 1.  концентрированной азотной кислоты 2.  сульфата меди 3.  азотнокислого серебра 4.  концентрированной щелочи 5.  сульфата аммония 18. Сульфгидрильную группу (тиогруппу) содержит аминокислота 1.  аспарагин 2.  гистидин 3.  лизин 4.  цистеин 5.  метионин 19. Методом ионообменной хроматографии нельзя разделить 1.  глутамат и лизин 2.  глутамат и лейцин 3.  лейцин и лизин 4.  лейцин и валин 5.  валин и глутамат 20. Денатурация белка всегда сопровождается 1.  нарушением третичной структуры белка 2.  гидролизом пептидных связей 3.  появлением окраски 4.  образованием функциональных комплексов с другими белками 5.  потерей нативных биологических свойств 21. Третичную структуру белков стабилизируют связи 1.  сложноэфирные 2.  гидрофобные 3.  водородные 4.  ионные 5.  дисульфидные 22. Нингидриновая реакция отрицательная с 1.  простыми белками 2.  дипептидами 3.  трипептидами 4.  свободными аминокислотами 5.  карбоновыми кислотами

23. Коллаген содержит много остатков 1.  гистидина 2.  глицина 3.  аспарагина 4.  лейцина 5.  глутамата 24. Незаменимые для человека аминокислоты 1.  лейцин 2.  аланин 3.  фенилаланин 4.  пролин 5.  аспарагин 25. Производным янтарной кислоты является 1.  глутаминовая кислота 2.  гистидин 3.  пролин 4.  триптофан 5.  аспарагиновая кислота 26. Молекулярную массу белков можно определить 1.  электрофорезом в полиакриламидном геле 2.  диализом 3.  ионообменной хроматографией 4.  колориметрически 5.  гель-фильтрацией 27. Альбумины растворимы в 1.  дистиллированной воде 2.  фосфатном буфере, pH=6,8 3.  полунасыщенном растворе сульфата аммония 4.  полунасыщенном растворе сульфата меди 5.  насыщенном растворе сульфата аммония 28. Смесь белков с различной молекулярной массой можно разделить 1.  гель-фильтрацией 2.  ультрафильтрацией через фильтры с молекулярным размером пор 3.  диализом 4.  ультрацентрифугированием 5.  высаливанием 29. Положительную ксантопротеиновую реакцию дают 1.  фенилаланин 2.  метионин 3.  триптофан 4.  аргинин 5.  аспарагин 30. Шапероны участвуют в образовании и поддержании главным образом 1.  первичной структуры белков 2.  первичной структуры нуклеиновых кислот 3.  третичной структуры белков 4.  третичной структуры нуклеиновых кислот 5.  вторичной структуры нуклеиновых кислот 31. Гидрофильными аминокислотами являются 1.  фенилаланин 2.  лейцин 3.  треонин 4.  серин 5.  аланин 32. Фолдинг белка – это 1.  формирование первичной структуры 2.  модификация аминокислотных остатков 3.  формирование третичной структуры 4.  транспорт в митохондрии 33. Незаменимые для человека аминокислоты 1.  изолейцин 2.  аланин 3.  глицин 4.  валин 5.  аспарагин 34. Аминокислоты с положительным зарядом в радикале 1.  гистидин 2.  валин 3.  аргинин 4.  лизин 5.  изолейцин 35. Аминокислота – производное глутаровой кислоты 1.  аспарагиновая кислота 2.  глутаминовая кислота 3.  аргинин 4.  лизин 5.  гистидин 36. Аминокислоты с отрицательным зарядом в радикале 1.  аспарагин 2.  глутамин 3.  глутамат 4.  аргинин 5.  аспартат 37. Белки с различной молекулярной массой нельзя разделить, используя 1.  трихлоруксусную кислоту 2.  гидроксид натрия 3.  сульфат меди 4.  сульфат аммония 38. Положительно заряженные белки 1.  альбумины 2.  глобулины 3.  глутелины 4.  гистоны 5.  протамины 39. Сложные белки 1.  протамины 2.  миоглобин 3.  гистоны 4.  флавопротеины 5.  гемоглобин 40. Для очистки белков от солей используют методы 1.  гель-фильтрации 2.  диализа 3.  бумажной хроматографии 4.  гидролиза 5.  все вышеперечисленные 41. Положительную реакцию Фоля дает 1.  триптофан 2.  гистидин 3.  тирозин 4.  треонин 5.  цистеин 42. Наиболее прочные связи в молекуле белка 1.  пептидные 2.  дисульфидные 3.  водородные 4.  ионные 5.  гидрофобные 43. Олигомерные белки отличаются от других белков наличием 1.  неупорядоченной структуры 2.  вторичной структуры 3.  третичной структуры 4.  четвертичной структуры 5.  доменного строения