Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 20 )

1.  1 2.  5 3.  1 4.  1, 2, 4 5.  2, 5 6.  3, 4, 5 7.  5 8.  2 9.  1, 2, 5 10. 1, 5 11. 1, 3 12. 3, 4, 5 13. 1 14. 5

15. 1, 3, 4 16. 1, 2, 3, 4 17. 2, 3, 4, 5 18. 1, 2 19. 4 20. 3, 4 21. 1 22. 2, 4, 5 23. 3 24. 3 25. 3 26. 1 27. 3, 5 28. 4

29. 4 30. 3 31. 3, 5 32. 3, 4 33. 3, 5 34. 1, 2, 3 35. 2 36. 3 37. 1, 2 38. 2 39. 1, 5 40. 3 41. 1 42. 2

43. 5 44. 1, 2, 3 45. 3 46. 4 47. 2 48. 1, 2, 4 49. 1 50. 4 51. 5 52. 3 53. 3, 6 54. 3 55. 2 56. 2

Раздел 6: Переваривание белков и обмен аминокислот

Введение

Белковому обмену принадлежит особое место среди других видов обмена веществ. Это объясняется выполнением белками специфических функций, которые не могут заменить ни углеводы, ни липиды: пластической, каталитической, иммунной.

В организме человека ежесуточно распадается до аминокислот (АМК) около 400 г белков и столько же синтезируется. Основным источником АМК для человека являются пищевые белки. Суточная норма потребления белков составляет около 100 г. Все 20 АМК, которые входят в состав белков организма, можно разделить на заменимые (синтезируемые самим организмом) и незаменимые (не синтезируются и должны поступать с пищей). Присутствие в пищевых белках всех незаменимых АМК определяет полноценность белкового питания человека.

Поскольку белки всех организмов отличаются строгой видовой и тканевой специфичностью, организм человека использует белки пищи только после их полного гидролиза до АМК в желудочно-кишечном тракте под действием ряда протеолитических ферментов – петидаз. Все пептидазы в зависимости от места расположения гидролизуемой пептидной связи подразделяются на:

1) эндопептидазы, гидролизующие пептидные связи, удалённые от концов пептидной цепи: пепсин, трипсин, химотрипсин, эластаза.

2) экзопептидазы, гидролизующие пептидые связи, образованные N - и C-концевыми аминокислотами: аминопептидаза, карбоксипептидаза, дипептидаза.

Желудочные и панкреатические пептидазы вырабатываются в неактивной форме, секретируются в месте действия, где активируются путём частичного протеолиза. Такой механизм образования активных ферментов необходим для защиты секреторных клеток желудка и поджелудочной железы от самопереваривания.

Переваривание белков в желудке происходит под действием пепсина. Профермент пепсиноген вырабатывается главными клетками слизистой желудка и при поступлении пищи секретируется в полость желудка. Пепсиноген активируется двумя способами:

1) соляной кислотой (медленно);

2) аутокаталитически (быстро) уже имеющимся пепсином.

Желудочный сок содержит соляную кислоту, которая вырабатывается обкладочными клетками желудка и выполняет следующие функции:

1) оказывает бактерицидное действие;

2) денатурирует белки пищи;

3) создаёт оптимум рН для пепсина;

4) активирует пепсиноген путём частичного протеолиза.

Переваривание белков в кишечнике происходит под действием:

1) ферментов поджелудочной железы: трипсина, химотрипсина, эластазы, карбоксипептидаз;

2) ферментов тонкой кишки: аминопептидаз, дипептидаз, трипептидаз.

Активная форма трипсина образуется в кишечнике при участии энтеропептидазы, которая отщепляет от N-конца трипсиногена гексапептид, что приводит к изменению конформации молекулы и формированию активного центра трипсина.

Остальные протеазы панкреатического сока: химотрипсиноген, прокарбоксипептидаза, проэластаза – активируются трипсином.

Активация панкреатических пептидаз происходит по каскадному механизму. Кишечные пептидазы синтезируются в энтероцитах сразу в активной форме.

Конечным результатом переваривания белков является образование свободных АМК, поступающих в клетки слизистой оболочки кишечника путём активного транспорта.

Большая часть свободных АМК, образующихся в результате переваривания белков, используется для синтеза собственных белков организма, часть на синтез биологически активных молекул: гормонов, биогенных аминов, а также нуклеотидов, гема, креатинфосфата и многих других соединений, в том числе глюкозы в процессе глюконеогенеза.

Важнейший путь превращения АМК в организме – это реакции трансаминирования с α-кетокислотами с образованием новых (заменимых) АМК.

Ещё один путь метаболизма – декарбоксилирование АМК с образованием биологически активных молекул – биогенных аминов. Основным коферментом обмена АМК является пиридоксальфосфат (ПФ).

Деградация АМК происходит путём их дезаминирования: безазотистые остатки могут использоваться для синтеза глюкозы (глюконеогенез) или, превращаясь в ацетил-КоА, окисляться до углекислого газа и воды с образованием энергии (различают гликогенные и кетогенные АМК).

В данном разделе приводится лабораторная работа по количественному анализу кислотности желудочного сока, позволяющая оценить содержание свободной, связанной, общей соляной кислоты, а также общей кислотности желудочного сока.

Процесс трансаминирования представлен двумя работами:

1) количественное определение аспартатаминотрансферазы (АсАт) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови, имеющее диагностическое значение при поражениях сердца и для дифференциальной диагностики болезней печени;

2) хроматографическое доказательство активности АлАТ.

Ранней диагностике наследственного заболевания – фенилпировиноградной олигофрении (фенилкетонурии) – посвящена работа по количественному определению фенилаланина в сыворотке крови.

Количественное определение конечных продуктов обмена белков представлено двумя лабораторными работами:

1) количественное опеделение мочевины в моче ферментативным (уреазным) методом;

2) колориметрический метод количественного определения креатинина в моче.

6.1. Количественный анализ желудочного сока. Определение свободной, связанной, общей соляной кислоты и общей кислотности желудочного сока.

Желудочный сок представляет собой бесцветную жидкость с сильнокислой реакцией (рН 1,5 – 2,0). За сутки у человека выделяется около 1,5 л желудочного сока; в его состав входят вода, неферментативные белки, ферменты (пепсин, гастриксин), муцин, фактор Касла, соляная кислота, гидрофосфаты и некоторые другие соединения.

Кислая реакция желудочного сока обусловлена присутствием соляной кислоты, гидрофосфатов, а при патологических процессах – молочной кислоты и жирных кислот. Совокупность всех веществ, способных быть донорами протонов, желудочного сока, составляют общую кислотность. Соляную кислоту, связанную с белками и продуктами их переваривания, называют связанной соляной кислотой, а находящуюся в несвязанном виде - свободной соляной кислотой. Содержание последней подвержено значительным колебаниям, тогда как количество связанной соляной кислоты достаточно постоянно.

В характере секреции желудочного сока различают следующие патологические изменения: 1) гиперхлоргидрию – увеличение содержания свободной соляной кислоты и общей кислотности. Такое состояние преимущественно наблюдается при язвенной болезни желудка; 2) гипохлоргидрию – уменьшение количества свободной соляной кислоты и общей кислотности; 3) ахлоргидрию – полное отсутствие соляной кислоты, общая кислотность при этом значительно снижена; 4) ахилию – отсутствие секреции желудочного сока.

Уменьшение или отсутствие соляной кислоты в желудке может наблюдаться при хроническом гастрите, раке желудка, злокачественном малокровии.

В клинике используют рН-метрию желудочного сока, однако полезную информацию можно получить простым, изящным способом, предложенным ниже.

Цель работы

Последовательно оттитровать один из трех образцов желудочного сока раствором NaOH в присутствии двух индикаторов и на основании расчетов сделать вывод о кислотности желудочного сока: нормальная, повышенная или пониженная. Сравнить с другими образцами и отметить характер изменения общей кислотности, а также общей, свободной и связанной соляной кислоты.

Принцип метода

Пользуясь различными индикаторами (диметиламиноазобензол и фенолфталеин) в одной и той же пробе желудочного сока определяют как общую кислотность, так и содержание общей, свободной и связанной соляной кислоты.

Общую кислотность желудочного сока выражают количеством миллилитров 0,1 М раствора NaOH, пошедших на титрование 100 мл желудочного сока в присутствии индикатора фенолфталеина (интервал перехода окраски pH 8,2 – 10). В норме общая кислотность составляет 40-60 титрационных единиц (ед.).

Свободную соляную кислоту выражают количеством миллилитров 0,1 М раствора NaOH, пошедших на титрование 100 мл желудочного сока в присутствии индикатора диметиламиноазобензола (интервал перехода окраски рН 1,0 – 3,0). В норме содержание свободной соляной кислоты составляет 20-40 ед.

Общая соляная кислота составляет сумму свободной и связанной с белками соляной кислоты (последнюю находят по разности между общей и свободной соляной кислотой).

Выполнение работы

В колбу для титрования вносят из бюретки 5 мл исследуемого желудочного сока. Добавляют 1 каплю раствора диметиламиноазобензола и 2 капли раствора фенолфталеина. Образуется розово-малиновое окрашивание. Пробу титруют 0,1 М раствором NaOH до оранжевого окрашивания и отмечают количество миллилитров щелочи, пошедших на титрование свободной соляной кислоты (условно называется I пункт титрования).

Далее титрование продолжают до появления лимонно-желтой окраски и отмечают общее количество миллилитров NaOH, пошедших на титрование от начала общего титрования (II пункт титрования). Затем титрование продолжают до появления малинового окрашивания и отмечают количество миллилитров щелочи, пошедших на титрование вновь от начала общего титрования (III пункт титрования).