Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 21 )

Расчеты

Допустим, что на титрование 5 мл желудочного сока до I пункта пошло от 0 до 1,5 мл 0,1 М раствора NaOH, до II от 0 до 2 мл и до III пункта – от 0 до 3 мл. Тогда общая кислотность составит 3 . 100/5 = 60 ед., количество свободной соляной кислоты - 1,5 . 100/5 = 30 ед., количество общей соляной кислоты (среднее арифметическое между II и III пунктом титрования) - (2+3)/2 . 100/5 = 50 ед., а количество связанной соляной кислоты находят по разнице между содержанием общей и свободной соляной кислоты: 50-30 = 20 ед.

Данные титрования и расчета вносят в таблицу (см ниже).

Оформление результатов

Пункт титрования	NaOH от 0 до соответ-ствующего пункта титрова- ния, мл	Окраска	Количество соляной кислоты (ед.)	Общая кислотность, ед.
свобод-ной	общей	связан-ной
I
II
III

Выводы

Тестовые задания по теме: «Превращение белков и дезаминирование аминокислот»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Протеиназы, амилазы и липазы относятся к классу гидролаз.

2.  Таурин является продуктом превращения цистеина.

3.  Скатол и индол образуются в кишечнике из аминокислоты тирозина.

4.  Соляная кислота в желудке способствует активации пепсиногена.

5.  При дезаминировании аминокислот в организме образуются биогенные амины.

6.  Пепсин относится к эндопептидазам.

7.  Можно ли заменить НАД+ на НАДФ+ в качестве кофермента глутаматдегидрогеназы?

8.  Происходит ли неокислительное дезаминирование цистеина у человека?

9.  Участвует ли трипсин в активации химотрипсиногена?

10. Возможно ли самопереваривание пепсина в желудке?

11. Относятся ли карбркси- и аминопептидазы к эндопептидазам?

12. Участвует ли уридиндифосфоглюкуроновая кислота в обезвреживании индола?

2) Выбрать один правильный ответ:

Коферментом дезаминирования аминокислот не может быть: 1.  НАД+ 2.  ФАД 3.  ФМН 4.  ТПФ 5.  ПФ

Заменимой аминокислотой для человека является: 1.  фенилаланин 2.  тирозин 3.  триптофан 4.  треонин 5.  метионин

3) Найти соответствие профермента и соответствующего катализатора

1. пепсиноген 2. трипсиноген 3. химотрипсиноген

А. трипсин Б. этеропептидаза В. НСl

6.2. Количественное определение аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови

Аспартатаминотрансфераза (АсАТ, КФ: 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (АлАТ, КФ: 2.6.1.2) – пиридоксальфосфатсодержащие ферменты.

АсАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы от аспартата на a-кетоглутарат с образованием глутамата и оксалоацетата.

АлАТ катализирует обратимую реакцию переноса аминогруппы от аланина на a-кетоглутарат с образованием глутамата и пирувата (ПВК).

АлАТ содержится в цитозоле, тогда как для АсАТ известны 2 формы: цитоплазматическая и митохондриальная.

При поражении тканей аминотрансферазы «вымываются» из поврежденных клеток в кровоток, поэтому определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет важное значение, особенно для диагностики поражений сердца и дифференциальной диагностики болезней печени. Так, при неосложненном инфаркте миокарда, уровень АсАТ в сыворотке крови начинает повышаться уже через 4-6 часов после наступления инфаркта, максимум активности приходится на вторые сутки и лишь на 5-8 день активность фермента снижается до нормы. Изменение активности сывороточной АлАТ при этом незначительно.

При инфекционном гепатите (болезни Боткина) и обострении хронического гепатита активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови повышаются (активность АлАТ повышается сильнее). Цирроз печени не сопровождается значительной гиперферментемией.

Цель работы

Определить активности обеих аминотрансфераз в сыворотке крови колориметрическим методом и сравнить полученные результаты с нормой.

Принцип метода

Определение активности обеих аминотрансфераз основано на колориметрическом обнаружении пирувата, образующегося за 1 час инкубации, по цветной реакции с 2,4-динитрофенилгидразином в щелочной среде. В случае АлАТ пируват образуется непосредственно из аланина, а в случае АсАТ пируват образуется из оксалоацетата после декарбоксилирования последнего в щелочной среде:

Аспартат + a-Кетоглутарат Глутамат + Оксалоацетат

Пируват CO2

Активности обоих ферментов определяют по калибровочному графику.

Выполнение работы[‡‡] (см. приложение )

Реагенты, этапы	Опыт	Контроль
Субстрат для АсАТ или АлАТ, мл	0,25	0,25
Физиологический раствор, мл	—	0,05
Сыворотка крови, мл	0,05	—
Инкубируют 60 минут при 37 °С
2,4-Динитрофенилгидразин, мл	0,25	0,25
Перемешивают и оставляют на 20 минут при 20 °С
Раствор NaOH , мл	2,5	2,5
Через 10 мин фотометрируют против Н2О (l = 500 нм, толщина кюветы 0,5 см) D540
Dоп – Dк

Расчет активности производят в мккат/л по калибровочному графику:

Активность АлАТ или АсАТ в мккат/л	Dоп – Dк
0,1	0,025
0,2	0,05
0,3	0,08
0,4	0,11

Норма: АлАТ = 0,05 – 0,12 мккат/л; АсАТ = 0,06 – 0,14 мккат/л. Верхний предел – 0,42 мккат/л.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Обмен аминокислот»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Тирозин является незаменимой аминокислотой для человека.

2.  В окислительном дезаминировании аминокислот могут участвовать разные коферменты.

3.  Реакции трансаминирования аминокислот необратимы.

4.  В процессах трансдезаминирования и трансреаминирования аминокислот участвует α-кетоглутаровая кислота.

5.  Коферентом аминотрансфераз служит ФАД.

6.  В процессе трансаминирования выделяется аммиак.

7.  Возможно ли превращение пировиноградной кислоты в аланин в организме человека?

8.  Является ли фенилаланин предшественником серотонина?

9.  Используют ли определение активности аспартатаминотрансферазы в сыворотке крови человека для диагностики инфаркта миокарда?

10. Нужен ли витамин В1 для реакций трансаминирования?

11. Усиливается ли глюконеогенез при сахарном диабете?

12. Участвуют ли лизин и треонин в реакциях трансаминирования?

2) Выбрать один правильный ответ

Метаболит ЦТК, участвующий в реакциях трансаминирования: 1.  цитрат 2.  изоцитрат 3.  сукцинат 4.  фумарат 5.  оксалоацетат

Гликогенной аминокислотой не является: 1.  аргинин 2.  глутамин 3.  гистидин 4.  лейцин 5.  метионин

3) Установить соответствие названия вещества и его предшественника

1. гистамин 2. γ-аминомасляная кислота 3. серотонин 4. таурин 5. дофамин

А. тирозин Б. триптофан В. цистеин Г. гистидин Д. глутамат

6.3. Доказательство проявления активности аланин-аминотрансферазы (АлАТ) методом бумажной хроматографии

Аланинаминотрансфераза (АлАТ), как и другие аминотрансферазы, участвует во взаимном превращении a-аминокислот и a-кетокислот в цитозоле клетки.

Аланин + a-Кетоглутарат Пируват + Глутамат

Поэтому активность АлАТ можно определить качественно по появлению в реакционной смеси новой аминокислоты, образовавшейся в результате переноса аминогруппы от аланина или глутамата на a-кетоглутарат или пируват соответственно (в зависимости от того в каком направлении проводится реакция).

Цель работы

Методом бумажной хроматографии показать наличие активности АлАТ и определить, какая аминокислота (аланин или глутамат) присутствовала в исходной субстратной смеси, то есть в каком направлении проводилась ферментативная реакция.

Принцип метода.

Поскольку в результате ферментативной реакции образуется новая аминокислота, осуществляют идентификацию исходной и образующейся под действием АлАТ аминокислот методом радиальной бумажной хроматографии (см. работу 1.4.Б «Хроматографическое разделение аминокислот»). Идентификацию проводят после окраски нингидрином по сравнению величин Rf исследуемых АМК со стандартными, которые разделяют одновременно в тех же условиях. Для решения задачи необходимо провести три независимых хроматографических разделения: 1) субстратной смеси (одна аминокислота); 2) субстратной смеси + АлАТ (образуется вторая аминокислота); 3) стандартного раствора аланина и глутамата для идентификации.