Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 17 )

Выводы

Тестовые задания по теме: «Проверка знаний материала предыдущего семестра»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Смесь свободных аминокислот дает положительную нингидриновую реакцию.

2.  Гидрофобность серина выше, чем валина.

3.  Специфичность действия ферментов определяется коферментом.

4.  Витамины А, В и С относятся к группе водорастворимых витаминов.

5.  Все гормоны имеют белковую природу.

6.  Глюкокортикоиды стимулируют глюконеогенез.

7.  Является ли ТПФ коферментом реакций карбоксилирования?

8.  Контролируется ли активность фосфорилазы путем фосфорилирования и дефосфорилирования?

9.  Происходит ли разрыв пептидных связей при тепловой денатурации белка?

10. Относится ли тимидин к пуриновым основаниям?

11. Все ли белки имеют четвертичную структуру?

12. Может ли глицерин в печени превращаться в глюкозу?

2) Выбрать один правильный ответ

Белки не могут выполнять функцию: 1.  каталитическую 2.  транспортную 3.  структурную 4.  коферментную 5.  защитную

При гидролизе лактозы образуются: 1.  глюкоза и галактоза 2.  манноза и глюкоза 3.  галактоза и фруктоза 4.  глюкоза и фруктоза 5.  две молекулы галактозы

3) Найти соответствие процесса и фермента, участвующего в нём

А. гликолиз Б. ЦТК

1. пируваткиназа 2. цитратсинтаза 3. фосфофруктокиназа 4. α-кетоглутаратдегидрогеназа 5. гексокиназа

5.2. Количественное определение фосфатидилхолинов (лецитинов) по фосфору

Фосфатидилхолины (лецитины) – это холиновые производные фосфатидной кислоты. Сочетание гидрофобных и гидрофильных участков в молекуле придает им амфифильные свойства.

Благодаря амфифильным свойствам фосфатидилхолины образуют гидрофильную оболочку жировых мицелл и обеспечивают всасывание высших жирных кислот и МАГ в кишечнике путем диффузии. Фосфатидилхолины входят в состав липопротеинов – транспортных форм липидов. При этом, липопротеины низкой (ЛПНП) и высокой (ЛПВП) плотности содержат соответственно 11-17 % и 24-40 % фосфолипидов, основную часть которых составляют фосфатидилхолины. Фосфатидилхолины служат основными компонентами биомембран, наиболее богаты ими клетки мозга, нервной ткани, сердца и печени.

Повышение уровня ЛПНП наблюдается при гиперлипопротеинемии II типа (семейная гиперхолестеринемия), гиперкортицизме, сахарном диабете, гипотиреозе. Понижение уровня ЛПНП происходит при синдроме мальабсорбции, муковисцидозе, тяжелом голодании. Количество ЛПВП повышается при хроническом алкоголизме и снижается при обтурационной желтухе, лимфогрануломатозе. Снижение интенсивности обмена фосфолицеридов в мозге имеет место при инсулиновой коме. Недостаток холина или метионина нарушает синтез фосфатидилхолинов в печени, что приводит к жировой инфильтрации печени.

Цель работы

Определить содержание фосфатидилхолинов в сыворотке крови и сравнить с нормой.

Принцип метода

Количество фосфатидилхолинов рассчитывают по содержанию фосфора. Сначала из пробы удаляют белки и экстрагируют фосфолипиды спиртом. Затем оставшиеся органические вещества разрушают путем минерализации в присутствии концентрированной серной кислоты. При этом, углерод превращается в СО2, водород в Н2О, азот в сульфат аммония, фосфор в анион фосфорной кислоты. После добавления пероксида водорода азот удаляется в виде летучих оксидов, и в пробе остается только нелетучий фосфор и его оксиды, количество которых определяют фотометрически в реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты по калибровочному графику.

Выполнение работы

I. Приготовление рабочего раствора сыворотки.

1. Депротеинизация сыворотки крови. В пробирку наливают 2 мл сыворотки крови и 5 мл спирта, перемешивают стеклянной палочкой, нагревают на водяной бане (800С) в течение 10 мин. Пробирку охлаждают и содержимое фильтруют через сухой фильтр в сухую пробирку.

2. Минерализация. Фильтрат (1 мл) переносят в тугоплавкую колбу Кьельдаля для сжигания и добавляют осторожно по стенкам колбы 10 капель концентрированной H2SO4. Через 15 минут после начала сжигания, в колбу Кьельдаля добавляют несколько капель пероксида водорода и продолжают нагревать до просветления жидкости. Колбу охлаждают и содержимое количественно переносят в мерную пробирку. Эти две стадии делаются предварительно, и студентам предлагается начать с нейтрализации полученного раствора.

3. Нейтрализация. Содержимое мерной пробирки доводят по бумажке с универсальным индикатором до рН = 7,0 (светло-зеленый цвет) 10%-ным раствором щелочи. В случае добавления избытка щёлочи проводят нейтрализацию 10%-ым раствором серной кислоты.

II. Определение концентрации фосфатидолхолинов по содержанию фосфора.

К содержимому мерной пробирки после нейтрализации добавляют 2,5 мл молибдата аммония и 0,5 мл 1% р-ра аскорбиновой кислоты, доводят водой до 10 мл. Пробу оставляют на 20 мин при комнатной температуре для развития окраски, а затем проводят измерение оптической плотности на ФЭК в кювете (1 см) при 670 нм. Схема определения представлена в таблице 1.

Параллельно строят калибровочную кривую (см. табл. 2). Расчёт содержания фосфора в пробе Сх (мкг/мл) проводят по калибровочному графику.

Схема определения оптической плотности исследуемого раствора, содержащего фосфор.

Реактивы и этапы	Пробы
Опыт	Контроль
1. Проба (мерная пробирка)	Весь объем	–
2. Молибдат аммония, мл	2,5	2,5
3. Аскорбиновая кислота, мл	0,5	0,5
4. Н2О	до 10 мл	до 10 мл
Термостатируют 20 минут при комнатной температуре
5. Фотометрируют против Н2О (λ= 670 нм, толщина кюветы 1 см) D670
Dоп - Dк

Данные для построения калибровочного графика

Содержание фосфора в стандартном растворе, мкг/мл (Сх)	Dоп-Dк
10	0,26
20	0,54
30	0,80

Расчет результатов

По калибровочному графику находят содержание фосфора в пробе (Сх) в мкг/мл. Коэффициент пересчета содержания фосфора в одном мл: 2/7 (2 мл сыворотки + 5 мл спирта (см. пункт 1 «Депротеинизация сыворотки крови»).

Ср = [г/л], где Ср – содержание фосфора в г/л

Так как усредненная молярная масса фосфатидилхолинов 750 г/моль, а фосфора 31 г/моль, то:

Содержание фосфатидилхолинов = [г/л]

Норма: 1,5 – 2,5 г/л.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Расщепление жиров, глицерина и высших жирных кислот»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Жиры расщепляются с образованием свободных жирных кислот.

2.  Пальмитиновая и олеиновая жирные кислоты являются ненасыщенными соединениями.

3.  Транспортной формой триацилглицеролов являются хиломикроны.

4.  Глицерин нельзя отнести к жирам.

5.  Наличие желчи ускоряет действие липазы.

6.  Активирование жирных кислот требует затраты энергии.

7.  Участвует ли карнитин в транспорте ВЖК внутрь митохондрии?

8.  Может ли глицерин в живой клетке превращаться в 3-фосфоглицериновый альдегид?

9.  Необходимо ли предварительное активирование жирной кислоты для синтеза нейтральных жиров?

10. Расщепляются ли белки под действием липазы?

11. Являются ли желчные кислоты производными циклопентанпергидрофенантрена?

12. Содержит ли фосфатидная кислота атом азота?

2) Выбрать один правильный ответ

Гормон, активирующий липазу в адипоцитах: 1.  инсулин 2.  адреналин 3.  кальцитонин 4.  окситоцин 5.  альдостерон

Биологической активностью обладают: 1.  моноациглицеролы 2.  диацилглицеролы 3.  триацилглицеролы 4.  глицерин 5.  все вышеперечисленные соединения

3) Установить соответствие для свободных и парных желчных кислот

Свободная Коньюгированная с глицином Коньюгированная с таурином

А. Тауродезоксихолевая Б. Холевая В. Гликохолевая Г. Литохолевая

5.3. Количественное определение холестерина в сыворотке крови

Холестерин (холестерол) – высший, полициклический, ненасыщенный одноатомный, вторичный спирт.

Большая часть холестерина в крови находится в виде холестеридов – сложных эфиров с высшими жирными кислотами: пальмитиновой, стеариновой или олеиновой. Холестерин и его эфиры нерастворимы в воде и образуют комплексные соединения со специфическими белками, которые являются обязательными компонентами ЛП сыворотки крови и клеточных мембран, влияют на физико-химические свойства плазматической мембраны, регулируют ее проницаемость и влияют на активность интегрированных в нее ферментов. Из холестерина образуются физиологически активные вещества: желчные кислоты, стероидные гормоны и провитамины группы D. Холестерин поступает в организм с пищей, но в основном синтезируется из ацетил-КоА в печени и, частично, в кишечнике. Из печени в ткани он попадает в составе ЛПНП. Избыток холестерина из тканей удаляется ЛПВП в печень. Холестерин – это основной компонент ЛПНП и минорный ЛПОНП и ЛПВП.