Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 16 )

1.  2, 3, 4 2.  2 3.  3 4.  3 5.  4 6.  4 7.  1 8.  5 9.  1 10. 1, 2, 3, 4 11. 4 12. 1, 2, 4 13. 1, 5 14. 3, 5 15. 4 16. 2 17. 1, 2, 4

18. 1, 2, 5 19. 4 20. 123 21. 4 22. 2 23. 2 24. 4 25. 3, 4 26. 2, 3, 4 27. 3, 4, 5 28. 2, 3 29. 2, 3, 4 30. 1, 2, 3, 5 31. 2 32. 4 33. 3 34. 1, 2, 3, 4

35. 1 36. 3, 4, 5 37. 1, 2, 5 38. 3, 5 39. 1 40. 2 41. 1, 2, 3, 4 42. 2, 3, 4 43. 1 44. 5 45. 1, 2, 3, 5 46. 1, 2, 4, 5 47. 2 48. 1 49. 1 50. 5 51. 1, 5 52. 1

Раздел 5: Обмен липидов и его регуляция

Введение

Роль липидов в организме человека и млекопитающих определяется их энергоёмкостью (запас легко высвобождаемой химической энергии) и участием в образовании клеточных мембран. Источником липидов являются в основном пищевые животного и растительного происхождения жиры. Кроме того, вместе с жирами в пищеварительный тракт поступают жирорастворимые витамины и незаменимые жирные кислоты: линолевая, линоленовая и арахидоновая.

Расщепление жиров до глицерина и свободных высших жирных кислот (ВЖК) происходит под действием липазы и конъюгированных (парных) желчных кислот в двенадцатиперстной кишке. В клетках кишечника всосавшиеся мицеллы, содержащие продукты гидролиза жиров, вступают в процесс ресинтеза, образуя жиры, свойственные данному организму. Транспорт липидов кровью к органам и тканям (вследствие их нерастворимости в воде) осуществляется сывороточными липопротеинами (ЛП). В данном разделе студентам предлагается определить кинетику действия липазы и влияние на этот процесс желчных кислот.

Жирные кислоты во многих тканях (особенно в печени и миокарде) вовлекаются в катаболический процесс – β-окисление - протекающий в митохондриях. Все превращения жирных кислот начинаются с их активации, т. е. с образования ацил-КоА. Биосинтез жирных кислот происходит в цитозоле и включает ряд последовательных стадий, завершающихся синтезом пальмитиновой кислоты. Центральную роль в обмене липидов занимает ацетил-КоА.

В синтезе сложных липидов в качестве строительных блоков используются жирные кислоты, глицерин, церамиды, аминоспирты и др. компоненты. В данном разделе предлагается лабораторная работа по определению сложных липидов – фосфатидилхолинов - по фосфору.

Биосинтез холестерина осуществляется преимущественно в печени из ацетил-КоА; важнейшими промежуточными соединениями при этом являются β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА (ГМГ-КоА), сквален и ланостерин. Холестерин в составе липопротеинов сыворотки крови переносится к другим органам и тканям, где входит в состав клеточных мембран и служит предшественником для синтеза стероидных гормонов. В данном разделе представлена практическая работа по количественному определению холестерина в сыворотке крови.

Под действием активных форм кислорода и свободных радикалов липиды, входящие в состав клеточных мембран, подвергаются пероксидному окислению, конечным продуктом которого является токсичный продукт – малоновый диальдегид (МДА), количественное определение которого предлагается провести в этом разделе.

5.1. Кинетика действия липазы.

Липаза – фермент поджелудочной железы, катализирующий гидролиз сложноэфирных связей в молекуле триацилглицеролов (ТАГ) в тонком кишечнике. Наиболее активно панкреатическая липаза катализирует гидролиз первой и третьей сложноэфирных связей ТАГ с образованием ди - и моноацилглицеролов (ДАГ и МАГ), затем осуществляется гидролиз 2-моноацилглицеролов. В кишечнике могут всасываться только продукты гидролиза ТАГ: глицерин, высшие жирные кислоты, ДАГ и МАГ.

Существенно облегчают процесс переваривания и всасывания липидов желчные кислоты: холевая и хенодезоксихолевая, а также их конъюгаты с глицином и таурином. Сочетание в химической структуре гидрофобной (стероидная часть) и гидрофильной частей придает парным желчным кислотам свойства поверхностно активных веществ (детергентов), которые, образуя микроэмульсию, активируют субстрат липазы и диффузию продуктов липолиза в эпителиальные клетки ворсинок кишечника. При этом фермент и субстрат находятся в разных фазах (несмешивающиеся жидкости) и взаимодействуют только на границе раздела фаз.

Величина поверхности контакта фермента и субстрата определяет скорость гетерогенного катализа: чем больше поверхность, тем выше скорость ферментативной реакции. Детергентное действие желчных кислот приводит к уменьшению силы поверхностного натяжения на границе раздела фаз и крупная капля жира распадается на множество мелких капель, доступных действию фермента.

Дефицит липазы чаще всего связан с заболеваниями поджелудочной железы и сопровождается панкреатической стеатореей (высокое содержание ТАГ в кале без изменения его окраски)

Нарушение экскреторной функции поджелудочной железы при перекрытии её протока (закупорка камнем, воспалительный процесс) при панкреатитах или непосредственном повреждении ткани железы (опухоль, атеросклероз сосудов, кровоизлияние и др.) существенно сказывается на жировом обмене. При стеаторее организм теряет воду и электролиты, затрудняется всасывание жирорастворимых витаминов.

Цель работы

Оценить кинетику действия липазы, определить характер влияния желчи на активность панкреатической липазы.

Принцип метода

В качестве источника нейтрального жира (ТАГ) используют молоко. Действие фермента оценивают по скорости образования кислых продуктов расщепления (свободных ВЖК). Для этого от общего объема смеси жира с липазой через определенные промежутки времени отбирают для титрования равные части. Титрование кислых продуктов гидролиза осуществляют раствором гидроксида натрия (индикатор – фенолфталеин):

R-COOH + NaOH → R-COONa + H2O

Результаты выражают в миллилитрах пошедшего на титрование раствора щелочи и представляют в виде графика зависимости содержания ВЖК в пробе от времени инкубации пробы.

Выполнение работы

В два стаканчика наливают по 10 мл разбавленного водой (1:1) молока. В один из стаканчиков вносят 1 мл желчи (проба 1), в другой – 1 мл Н2О (проба 2). Из каждой пробы отбирают в колбу для титрования по 2 мл образовавшейся смеси и титруют 0,01 М раствором NaOH в присутствии фенолфталеина до появления розового окрашивания. Затем в каждую пробу добавляют по 1 мл раствора липазы (вытяжка из поджелудочной железы). Быстро перемешивают струей из пипетки и отмечают время начала реакции. Повторные титрования проводят через каждые 5 минут.

Значение титрования без липазы (время реакции «0») вычитают из величины последующих титрований. В этом случае полученные графики пройдут через начало координат, так как вычитается исходное количество органических кислот, присутствующих в молоке (исходная кислотность молока). Полученные результаты оформляют в виде графика, показывающего динамику отщепления свободных ВЖК во времени под действием липазы в присутствии и в отсутствие желчи.

Пример графика динамики отщепления свободных ВЖК во времени под действием липазы в присутствии (кривая 1) и в отсутствие (кривая 2) желчи.

Схема определения

I. Приготовление исходной смеси (в стаканчиках)
Реактивы и этапы	Проба 1	Проба 2
1. Молоко, разбавленное водой (1:1) 2. Вода 3. Желчь	10 мл - 1 мл	10 мл 1 мл -
II. Определение исходной кислотности молока
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Исходная смесь (отбирают аликвоту из стаканчика в колбу для титрования) 2. Фенолфталеин (добавляют в каждую колбу) Титруют пробы раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V0 и V0 ’).	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап
III. Отбор смеси и титрование в присутствии липазы
К оставшейся исходной смеси в оба стаканчика быстро добавляют по 1мл липазы и отмечают время. Через каждые 5 минут отбирают аликвоты в колбы для титрования
	Колба для титрования 1	Колба для титрования 2
1. Аликвота 2. Фенолфталеин Быстро титруют раствором NaOH (до розового цвета). Значения записывают в таблицу результатов (V и V ’) Повторные титрования проводят через каждые 5 минут и результаты заносят в следующую таблицу.	2 мл 1-2 кап	2 мл 1-2 кап

Оформление результатов

t, мин	проба № 1 (с желчью)	проба № 2 (без желчи)
V(NaOH), мл	V-V0	V’(NaOH),мл	V’-V0 ’
0 (определение исходной кислотности молока)	V0 =	0	V0 ’=	0
5	V =		V’=
10
15
20
		по полученным данным строят кинетическую кривую № 1		по полученным данным строят кинетическую кривую № 2