Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 26 )

Цель работы

Определить суточное выделение мочевой кислоты с мочой и сравнить с нормальными величинами.

Принцип метода

Метод основан на способности мочевой кислоты восстанавливать в щелочной среде бесцветный фосфорно-вольфрамовый реактив в соединение синего цвета. При титровании этого соединения раствором красной кровяной соли K3[Fe(CN)6] раствор обесцвечивается. Израсходованное количество красной кровяной соли соответствует количеству мочевой кислоты.

Выполнение работы (см. приложение )

К 2,5 мл свежевзятой мочи прибавляют 1мл 30% раствора NaOH и 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива. Раствор приобретает синее окрашивание.

Затем раствор титруют щелочным раствором красной кровяной соли (0,0015М) до обесцвечивания. Отмечают объем красной кровяной соли, пошедшей на титрование (V в литрах).

Расчет

Количество мочевой кислоты в 2,5 мл мочи составляет 0,0015 . V моль, в 1 л – 0,0015 . 400 . V = 0,6 . V моль/л. Зная относительную молекулярную массу мочевой кислоты (Mr = 168), рассчитываем ее массу в 1 литре: m = 0,6 . V. 168 = 100,8 . V г. Принимая суточный диурез 1,5 л, получают величину суточной экскреции мочевой кислоты с мочой:

100,8 . V. 1,5 = 151,2 . V г/сутки,

конечная формула расчета:

экскреция мочевой кислоты = 0,0015· V·400·168·1,5 г/сутки,

где 0,0015 – концентрация K3[Fe(CN)6] в моль/л;

V – объем K3[Fe(CN)6] в л, пошедший на титрование;

168 – молярная масса мочевой кислоты в г/моль;

1500 – суточный диурез мочи в мл;

2,5 – исходная проба мочи в мл.

Норма: 0,3 – 1,2 г/сутки.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Распад и синтез нуклеотидов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Азотистые основания пищи используются для биосинтеза нуклеиновых кислот нашего организма.

2.  Источником NH2-группы при синтезе ГМФ из инозиновой кислоты является глутаминовая кислота.

3.  Конечный продукт распада аденозина у человека - мочевая кислота.

4.  Концентрация мочевой кислоты в крови человека - в норме 0,2 г/ л.

5.  Регуляция синтеза пиримидиновых оснований осуществляется по типу обратной связи.

6.  Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основном в виде мочевой кислоты.

7.  Участвует ли аспарагин в биосинтезе пуринового ядра?

8.  Может ли ЦМФ образоваться из УМФ?

9.  Является ли β-аланин конечным продуктом катаболизма ТМФ в организме человека?

10. Участвует ли карбамоилфосфат в синтезе пиримидиновых нуклеотидов?

11. Применяется ли ингибитор ксантиноксидазы для лечения подагры?

12. Только ли тиоредоксин участвует в восстановлении рибозы до дезоксирибозы?

2) Выбрать один правильный ответ

Источником NH2-группы при синтезе АМФ из инозиновой кислоты является: 1.  мочевина 2.  аспарагиновая кислота 3.  аспарагин 4.  карбамоилфосфат 5.  ион аммония

Конечный продукт катаболизма ТМФ в организме человека: 1.  мочевая кислота 2.  β-аминоизомасляная кислота 3.  инозиновая кислота 4.  креатин 5.  β-аланин

3) Найти соответствие Y (буква) и X (цифра) в следующей цепи превращений:

	X		X
Гипоксантин		Y		Мочевая кислота

1. дегидрогеназа 2. оксигеназа 3. оксидаза 4. гидроксилаза

А. инозин Б. аденин В. гуанин Г. аллантоин Д. ксантин

7.3. А. Определение активности a-амилазы в моче

a-Амилаза (КФ 3.2.1.1) – фермент, катализирующий гидролитическое расщепление 1,4-a-гликозидных связей в молекулах крахмала и гликогена.

В организме человека основными источниками a-амилазы являются поджелудочная железа и слюнные железы, в которых существует 2 семейства изоферментов амилазы, соответственно P и S.

Изоферменты P – образуются только в поджелудочной железе. Изоферменты S – преимущественно в слюнных железах, а также в других органах и тканях. Доля изоферментов P в общей активности a-амилазы значительно выше в моче, чем в сыворотке крови.

Резкое (в 10-30 раз) повышение активности a-амилазы в сыворотке крови и в моче наблюдается при остром панкреатите (в первые сутки).

Цель работы

Определить активность a-амилазы в моче и сравнить с нормой.

Принцип метода

Существует много разных методов определения активности a-амилазы. Мы познакомимся с простым и надежным методом последовательных разведений фермента, предложенным еще в 1929 г. Вольгемутом и сохранившимся до настоящего времени. Метод основан на определении максимального разведения мочи, при котором происходит полное расщепление крахмала (отсутствие цветной реакции с иодом) при заданных условиях.

Выполнение работы

Получение последовательных разведений мочи: в 6 пробирок наливают по 1 мл 0,85% раствора NaCl. В первую пробирку вносят 1 мл мочи (тщательно перемешивают). 1 мл смеси из первой пробирки переносят во вторую, перемешивают. 1 мл из второй пробирки переносят в третью пробирку и т. д. Из последней пробирки, после перемешивания, 1 мл выливают в раковину.

В результате получают ряд последовательных разведений мочи (1:2; 1:4; 1:8 и т. д. Во все пробирки быстро вносят по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляют по 1 капле 1% раствора йода и тщательно перемешивают. Результаты окраски растворов в пробирках заносят в таблицу:

Проба	1	2	3	4	5	6
Разведения	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64
Окраска с иодом

Отмечают последнюю пробирку, в которой произошло полное расщепление крахмала (желтое окрашивание с иодом) и рассчитывают активность a-амилазы.

Расчет активности a-амилазы

За условную единицу активности (ед. Вольгемута) принимают активность необходимую для расщепления 1 мл 0,1% раствора крахмала при комнатной температуре за 30 мин.

А = 2 . Р [ед. Вольгемута]

2 (мл) – объем 0,1% крахмала

Р – разведение (см. таблицу), например 1-я пробирка – разведение 2,

6-я пробирка – разведение 64.

Норма: от 16 до 64 условных единиц Вольгемута.

Выводы

7.3. Б. Составные части мочи в норме и при патологии

Для обеспечения нормальной жизнедеятельности химический состав организма должен быть относительно постоянным. Для этого необходимы процессы удаления избытка воды и электролитов, а также продуктов метаболизма. Основным органом, регулирующим состав водо-растворимых химических компонентов организма, являются почки. В составе мочи обнаружено более 150 химических ингредиентов. Следует отметить, что широко используемое понятие «патологические компоненты мочи» в известной мере условно, так как большинство соединений, рассматриваемых как патологические компоненты мочи, хотя и в небольшом количестве, но могут присутствовать в нормальной моче. Другими словами, речь идет о веществах, которые в моче здорового человека не встречаются в аналитически определяемых количествах. Это, прежде всего белки, глюкоза, кетоновые тела, билирубин и гемоглобин.

Для обнаружения этих веществ можно использовать экспресс-методы полуколичественного анализа. Это так называемые тест-полоски.

Цель работы

Провести экспресс-тесты с 5 образцами мочи. Определить рН каждого из образцов, а также содержание белка, кетоновых тел, глюкозы. Проанализировать полученные результаты.

Принцип метода

О концентрации того или иного реагента можно судить по изменению окраски сенсорной зоны, сопоставив полученный результат с соответствующей цветной шкалой на упаковке.

Сенсорная или реакционная зона любой тест-полоски (для определения глюкозы, кетонов, белка, нитритов, билирубина, уробилиногена и т. д.) представляет собой некую матрицу, в которой находится много различных сбалансированных  химических компонентов.  Наряду с химическими компонентами в некоторые сенсорные зоны тест-полосок вводят ферменты, специфически взаимодействующие с определяемым веществом в пробе. Тест-полоски с наличием ферментов в сенсорной  зоне называют ферментативными.

Чтобы результаты были корректными, определение необходимо проводить в строгом соответствии с прилагаемой инструкцией по применению.

Реагенты, используемые в сенсорной зоне (см. приложение ).

№ п/п	Анализируемое соединение	Рабочий реагент
1	белок	Эфир тетрабромфенолфталеина, тетрабромфеноловый синий
2	глюкоза	Глюкозооксидаза, пероксидаза, тетраметилбензидин
3	кетоновые (ацетоновые) тела	Натрия нитропруссид
4	рН	Метиловый красный, бромтимоловый синий

Примечание:

Белок - проба наиболее чувствительна к альбумину, значительно менее чувствительна к глобулинам, мукопротеинам, гемоглобину и белку Бенс-Джонса. На определение белка не влияет величина рН мочи, но в сильно щелочной моче (рН выше 8) или в моче с высокой буферной емкостью тест может дать ложноположительные результаты. Не обращайте внимания на окраску сухой зоны.