Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 6 )

Правильные ответы

1.  1, 3, 4, 5 2.  3, 5 3.  1, 4 4.  2, 4, 5 5.  3 6.  3 7.  5 8.  2 9.  1, 3, 5 10. 3 11. 1, 2, 3, 5 12. 2 13. 1, 2, 4 14. 1, 2, 5 15. 1, 2, 3, 5

16. 2 17. 1, 2, 3, 4 18. 4 19. 4 20. 1, 5 21. 2, 3, 4, 5 22. 5 23. 2 24. 1, 3 25. 5 26. 1, 5 27. 1, 2, 3 28. 1, 2, 4, 5 29. 1, 3 30. 3

31. 3, 4 32. 3 33. 1, 4 34. 1, 3, 4 35. 2 36. 3, 5 37. 1, 2, 3 38. 4, 5 39. 2, 4, 5 40. 1, 2 41. 5 42. 1 43. 4

Раздел 2: Сложные белки, нуклеиновые кислоты и ферменты

Введение

Как уже было сказано во введении к разделу 1, сложные (конъюгированные) белки построены из белковой и небелковой части. В качестве небелковой части (простетической группы) сложных белков могут выступать различные химические соединения, что находит отражение в классификации данной группы биологических соединений:

Хромопротеины

Нуклеопротеины

Липопротеины

Фосфопротеины

Гликопротеины

Металлопротеины

Хромопротеины содержат окрашенную простетическую группу, например, красные белки - гемопротеины (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза), желтые белки - флавопротеины (ферменты класса оксидоредуктаз, содержащие производные рибофлавина).

Нуклеопротеины в качестве простетической группы содержат ДНК или РНК, что объясняет их участие в экспрессии генов и биосинтезе белка.

Липопротеины содержат такие липиды как триацилглицеролы, свободные жирные кислоты, эфиры холестерина, фосфолипиды и отличаются друг от друга процентным содержанием белка и плотностью. Липопротеины встречаются как в свободном виде (ЛП плазмы крови), так и в структурированном (в составе клеточных и внутриклеточных биомембран).

Фосфопротеины участвуют в процессе эмбриогенеза. Это такие белки как казеиноген молока, вителлин и фосвитин куриного желтка, ихтулин икры рыб. Известно, что фосфорилирование-дефосфорилирование белков и ферментов – способ изменения их функциональной активности.

Гликопротеины являются объектом интенсивного исследования, что объясняется многообразием их строения и выполняемых функций. Это гликоконъюгаты, к котрым относят большинство белковых гормонов, антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови и молока, интерфероны, факторы комплемента, рецепторные белки.

Металлопротеины представляют белки, содержащие в своей структуре ионы металла (железа, меди, кобальта, марганца, молибдена, цинка, магния, кальция и др.). Типичные представители металлопротеинов, содержащих негемовое железо, – это ферритин, трансферрин, гемосидерин.

Нуклеиновые кислоты относят к высокомолекулярным соединениям, состоящим из пуриновых и пиримидиновых оснований, остатков рибозы или дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Данный класс соединений выполняет функцию хранения и передачи наследственной информации, а структурные компоненты нуклеиновых кислот (нуклеотиды) входят в состав коферментов (НАД+, ФАД, КоА), являются макроэргическими соединениями (АТФ, УТФ, ЦТФ, ГТФ, ТТФ) и вторичными посредниками (цАМФ, цГМФ) в передаче внутриклеточного сигнала.

Изучение ферментов (энзимов) выделено в отдельную науку – энзимологию. Все ферменты имеют белковую природу, чем объясняются их свойства (термолабильность, зависимость активности от рН среды, высокоспецифичное действие по отношению к реагирущим веществам – субстратам ферментативной реакции). Ферменты являются биокатализаторами, т. е. ускоряют химические реакции (такой способностью обладают ещё только некоторые РНК, которые называют рибозимами). Активность ферментов выражается в каталах (количество фермента, которое превращает 1 моль субстрата за 1 с), а также в международных единицах (Е) (количество фермента, превращающего 1 мкмоль субстрата за 1мин). Все изученные ферменты включены в особый каталог (классификация ферментов – КФ) и имеют свой классификационный номер, в котором первая цифра указывает на принадлежность к одному из 6 классов ферментов:

1) оксидоредуктазы

2) трансферазы

3) гидролазы

4) лиазы

5) изомеразы

6) лигазы (синтетазы)

Лабораторный практикум в рамках этой темы охватывает изучение влияния температуры на активность фермента и скорость химической реакции (на примере амилазы), а также изучение специфических фермент-субстратных отношений (амилаза – крахмал; щелочная фосфатаза - п-нитрофенилфосфат).

2.1 Действие амилазы на крахмал. Влияние температуры на активность амилазы

А. Действие амилазы на крахмал

Фермент амилаза (a-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, КФ: 3.2.1.1) осуществляет гидролиз крахмала через промежуточные продукты распада (декстрины) до мальтозы. Последняя под влиянием фермента мальтазы расщепляется на две молекулы глюкозы. В слюне содержатся амилаза и мальтаза, так что слюна способна расщеплять крахмал до глюкозы.

Основным источником амилазы в организме человека является поджелудочная железа, секретирующая фермент в кишечник, где происходит расщепление поступающего с пищей крахмала.

Цель работы

Определить время полного расщепления крахмала амилазой слюны.

Принцип метода

Нерасщепленный крахмал с иодом дает синее окрашивание, а декстрины, в зависимости от размера молекул, дают с иодом последовательно фиолетовую, красно-бурую, оранжевую окраску, тогда как мальтоза и глюкоза окрашивания с иодом не дают. Таким образом, можно наблюдать за скоростью расщепления крахмала по реакции с иодом. Активность амилазы в слюне не имеет большого физиологического значения и может значительно отличаться у разных людей.

Выполнение работы

В 9 пробирок наливают по 2 мл дистиллированной воды и добавляют по 1 капле 1% раствора иода. Отдельно в стаканчик наливают 5 мл 0,5% раствора крахмала. Из стаканчика берут пробу - 1 каплю, вносят в первую пробирку и перемешивают, в результате чего раствор в пробирке окрашивается в синий цвет. В стаканчик быстро вносят 5 капель слюны, энергично перемешивают и замечают по секундомеру время. Через 20 секунд берут из стаканчика пробу – 1 каплю и вносят во вторую пробирку. Если жидкость в пробирке станет фиолетовой или красной, то пробы из стаканчика нужно отбирать и вносить в пробирки через каждые 20 секунд. Если жидкость в пробирке № 2 окрасится в синий цвет, то пробы следует отбирать через более длительные интервалы времени, например через 1 минуту. Когда в одной из пробирок цвет раствора иода не изменится, гидролиз крахмала считают законченным. Фиксируют время, затраченное на полное расщепление крахмала. Результаты опыта записывают в виде таблицы:

№ пробирок	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Окраска жидкости

Выводы

Б. Изучение влияния температуры на скорость ферментативной реакции

При увеличении температуры скорость ферментативных реакций возрастает так же, как и скорость всех химических реакций: с повышением температуры на 10 о С скорость реакции увеличивается в 2-4 раза. В отличие от неферментативных процессов такое увеличение скорости ферментативных реакций наблюдается в узком интервале температур. Температура, при которой на графике зависимости скорости реакции от температуры наблюдается наибольшая скорость реакции, называется температурным оптимумом и обозначается tопт и для ферментов теплокровных животных чаще всего лежит в пределах 37-40о С. При более высоком значении температуры становится заметным влияние на фермент термической инактивации (тепловая денатурация белковой молекулы). Существенное падение скорости большинства ферментативных процессов наблюдается после достижения 42 - 50оС.

Цель работы

Оценить скорости ферментативной реакции, катализируемой амилазой, при трех различных температурах и определить температуру, при которой фермент наиболее активен.

Принцип метода

Образование окрашенного комплекса крахмала с иодом (см. предыдущую работу).

Выполнение работы

Для работы берут образец слюны, расщепляющей 5 мл крахмала примерно за 1 мин по методике, описанной в предыдущей работе.

	Реактивы и этапы	0 оС	комн.	100 оС
1.	Вносят в пробирки 0,5% раствор крахмала, капли. Доводят раствор крахмала до нужной температуры.	20	20	20
2.	Добавляют раствор слюны, разведенной дистиллированной водой в 10 раз, капли	10	10	10
3.	Перемешивают и инкубируют при нужной температуре
		Окраска
4.	Через каждые 15 секунд отбирают из пробирок пробы по 3 капли и анализируют на предметном стекле, добавляя 1 каплю 1% раствора иода и отмечая окраску.	15 с
30 с
45 с
60 с
75 с
5.	Отмечают, в какой пробирке весь крахмал расщепляется быстрее всего.

Выводы