Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 27 )

Определение глюкозы основано на ферментативной (глюкозаоксидаза/пероксидаза) реакции, тест специфичен для глюкозы, другие сахара не взаимодействуют. Реакция не зависит от рН и присутствия кетоновых тел.

Кетоны - проба значительно чувствительнее к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону. С бета-гидроксимасляной кислотой проба не реагирует. Лекарственные и диагностические препараты на основе фенолфталеина или сульфонфталеина, присутствующие в моче, могут в щелочной среде зоны окрашиваться в красный и даже пурпурный цвет. Цветная шкала сравнения на этикетке отражает концентрацию ацетоуксусной кислоты в моче.

Предварительно лаборанты готовят 5 образцов: один с нормальной мочой, а каждый следующий отличается от нормы по одному из исследуемых показателей.

Выполнение работы

Тест-полоску опускают на 1-2 с. в исследуемый образец так, чтобы сенсорные зоны были смочены. Капли мочи с полоски удаляют, проведя полоской по краю сосуда с мочой. Полоску оставляют в горизонтальном положении. Приблизительно через 60 с. сопоставляют окраску зон индикации с соответствующей цветной шкалой.

Оформление работы

	I обра-зец	II обра-зец	III обра- зец	IV обра- зец	V обра- зец
рН
Белок
Глюкоза
Кетоно-вые тела

Выводы

Тестовые задания по теме: «Интеграция обмена основных классов органических соединений. Использование ферментов в медицине»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Анаболические и катаболические процессы чаще всего разобщены пространственно.

2.  Основное количество АТФ для биоситеза белка образуется за счет окислительного фосфорилирования.

3.  Печень занимает центральное место в обмене белков, углеводов и липидов.

4.  Активность трансаминаз в сыворотке крови в норме значительно выше, чем в тканях.

5.  Активность щелочной фосфатазы в сыворотке крови повышается при рахите.

6.  Определение активности кислой фосфатазы сыворотки крови специфично для заболеваний предстательной железы.

7.  Повышается ли активность амилазы при панкреатитах?

8.  Используется ли L-аспарагиназа для лечения лейкозов?

9.  Информативно ли электрофоретическое разделение белков сыворотки крови?

10. Определяют ли активность КФК в сыворотке крови для диагностики заболеваний печени?

11. Повышается ли содержание изоферментов ЛДГ1 и ЛДГ2 при инфаркте миокарда?

12. Специфичен ли глюкозоксидазный метод определения глюкозы?

2) Выбрать один правильный ответ

Синтез АТФ из АДФ в печени происходит, в основном, путем: 1.  реакции с ГТФ 2.  окислительного фосфорилирования 3.  субстратного фосфорилирования 4.  взаимодействия с ФФн 5.  реакции с ЦТФ

При инфаркте миокарда в крови положительны следующие тесты: 1.  повышение активности АсАТ и АлАТ 2.  увеличение содержания ЛДГ1 и ЛДГ2 3.  повышение активности КФК 4.  увеличение содержания МВ-изоформы КФК 5.  положительны все перечисленные тесты

3) Установить соответствие суточного выделения с мочой в норме следующих метаболитов:

1. мочевина 2. креатинин 3. мочевая кислота 4. хлорид натрия

А. 0,6 г/сут Б. 30 г/сут В. 10 г/сут Г. 1,5 г/сут

7.4. Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови

Холинэстераза – это фермент, который катализирует гидролиз эфиров холина:

(СН3)3-N+-СН2-СН2-О-С(О)-СН3 (СН3)3-N+-СН2-СН2-ОН + СН3СООН

Различают два типа холинэстераз, которые обозначают как истинную холинэстеразу (ацетилхолинэстераза) и псевдохолинэстераза (холинэстераза – ХЭ). Истинная холинэстераза (ацетилхолингидролаза, КФ 3.1.1.7.) отличается узкой субстратной специфичностью, гидролизует преимущественно ацетилхолин. Псевдохолинэстераза (ацетилхолин-ацилгидролаза, КФ 3.1.1.8.) обладает более широкой субстратной специфичностью и гидролизует другие эфиры холина.

Истинная холинэстераза локализована в эритроцитах, мышечной и нервной тканях, играет важную роль в передаче нервного импульса путем разрушения ацетилхолина в нервных синапсах и в нервно-мышечном сопряжении.

Псевдохолинэстераза присутствует в сыворотке крови, печени, поджелудочной железе и других внутренних органах.

При заболеваниях и поражениях печени активность холинэстеразы в сыворотке крови снижается, т. к. нарушается синтез фермента гепатоцитами. Низкий уровень ХЭ может наблюдаться при раковых заболеваниях, острых инфекциях, инфаркте миокарда, беременности, а также у курильщиков.

Активность ХЭ сыворотки крови снижается при отравлениях фосфорорганическими соединениями, инсектицидами, нервно-паралитическими газами или другими сходными по химическому строению веществами, которые являются сильными ингибиторами ХЭ.

Повышенный уровень ХЭ может наблюдаться при интенсивных физических тренировках, а также при приеме ряда терапевтических препаратов.

Цель работы

Определить активность фермента холинэстеразы в сыворотке крови и сравнить с нормой.

Принцип метода

В ходе реакции, катализируемой холинэстеразой, образуется уксусная кислота, что приводит к снижению рН реакционной среды. Если проводить реакцию в присутствии индикатора (м-нитрофенола), то при понижении рН наблюдается обесцвечивание раствора, пропорциональное ферментативной активности ХЭ. Для определения фонового оптического поглощения готовят контрольный раствор, в котором холинэстеразную активность сыворотки ингибируют прозерином. При 400 нм измеряют оптическую плотность в контрольной и опытной пробах, и их разность используют для вычисления активности ХЭ по калибровочному графику зависимости Dк–Dоп от активности ХЭ. За единицу активности холинэстеразы (ед.) принимают такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоль уксусной кислоты из ацетилхолина за 10 мин при 25оС.

Прозерин

Выполнение работы (см. приложение )

Маркируют две пробирки и вносят в них последовательно (перемешивая содержимое пробирок после добавления каждого реагента):

	Этапы и реактивы	Опыт	Контроль
1.	Физиологический раствор, мл	0,2	0,2
2.	Сыворотка крови, мл	0,2	0,2
3.	Прозерин, мл	-	0,2
4.	Ацетилхолин, мл	0,2	0,2
5.	Н2О, мл	3,0	2,8
6.	Инкубируют 10 минут при температуре 25°С
7.	Раствор м-нитрофенола, мл	2,0	2,0
8.	Фотометрируют против Н2О (l = 400 нм, толщина кюветы 1 см) D400	Do	Dк
9.	Dк–Dоп

Определяют активность холинэстеразы по калибровочному графику зависимости Dк–Dоп от активности ХЭ.

Калибровочный график

Активность холинэстеразы, ед.	Dк – Doп
20 40 60 80 100 120	0,08 0,12 0,20 0,25 0,30 0,35

Норма: 40-120 единиц.

Выводы

Тестовые задания по теме: «Нормальные и патологические составные части крови и мочи»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  Креатин в норме определяется в сыворотке крови и моче.

2.  Содержание холестерина и мочевины в крови (ммоль/л) сопоставимо с содержанием глюкозы.

3.  В сыворотке крови в норме больше пировиноградной кислоты, чем молочной.

4.  Содержание глутамина в сыворотке крови (мкмоль/л) сопоставимо с концентрацией аланина.

5.  Общий билирубин определяется как в сыворотке крови, так и в моче.

6.  Протеинурия может выражаться в появлении в моче альбуминов.

7.  Возможно ли выведение ацетоновых тел с мочой более 100 г/сутки при сахарном диабете?

8.  Является ли фосфатидилхолин нормальным компонентом сыворотки крови?

9.  Атерогенны ли ЛПВП?

10. Нормально ли выведение 10 г/сутки хлористого натрия с мочой?

11. Сопоставимо ли суточное выведение мочевины, креатинина и мочевой кислоты с мочой?

12. Присутствует ли стеркобилин в моче?

2) Выбрать один правильный ответ

Азот пиримидиновых оснований выводится из организма в основном в виде: 1.  мочевой кислоты 2.  креатинина 3.  β-аланина 4.  мочевины 5.  креатина

Патологическими компонентами мочи не являются: 1.  белки 2.  кетоновые тела 3.  глюкоза 4.  сульфаты 5.  билирубин

3) Установить соответствие между поражённым органом и повышением активности фермента в сыворотке крови

1. инфаркт миокарда 2. поражение клеток печени 3. воспаление поджелудочной железы 4. карцинома предстательной железы

А. орнитинкарбамоилтрансфераза Б. амилаза В. кислая фосфатаза Г. креатинкиназа

7.5. Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови

Лактатдегидрогеназа, ЛДГ (L-лактат: НАД-оксидоредуктаза; КФ 1.1.1.27) – цитоплазматический цинксодержащий гликолитический фермент, обратимо катализирующий восстановление пировиноградной кислоты в молочную кислоту: