Руководство к практическим занятиям по биохимии (стр. 18 )

На содержание холестерина в сыворотке крови влияют различные факторы: наследственность, питание, состояние эндокринных желез и внутренних органов (печень, почки). Так например, повышение уровня холестерина в сыворотке крови наблюдается при атеросклерозе, семейной гиперхолестеринемии, декомпенсированном сахарном диабете, нефротическом синдроме, хроническом гепатите, гипопротеинемии. Понижение концентрации холестерина происходит при остром гепатите, болезни Гоше, острых инфекциях, кахексии, анемии, остром панкреатите. Исследуется роль холестерина в процессах нейродегенерации и развитии болезни Альцгеймера.

Цель работы

Определить содержание холестерина в сыворотке крови. Сравнить полученное значение с нормой.

Принцип метода

Холестеринэстераза гидролитическим путем расщепляет сложноэфирную связь в эфирах холестерина (холестеридах). Образовавшийся свободный холестерин как спирт окисляется холестериноксидазой до кето-формы холестерина (холестенона) и пероксида водорода. Последний под действием пероксидазы способен окислять фенол при участии 4-аминоантипирина до окрашенного соединения - хинонимина. Оптическую плотность окрашенного раствора хинонимина определяют фотометрически. Расчёт концентрации холестерина проводят по сравнению со стандартным раствором.

Выполнение работы (см. приложение)

Реактивы и этапы	Пробы
Опыт	Контроль	Стандарт
	1. Реагент, мл (хромогенная смесь*)	2	2	2
	2. Сыворотка крови, мл **	0,05	—	—
	3. Н2О, мл	—	0,05	—
	4. Стандартный раствор холестерина (4,65 ммоль/л), мл	—	—	0,05
	Инкубируют 10 мин при 25°С
	Фотометрируют против Н2О (l = 500 нм, толщина кюветы 3 мм) D500
	Dоп - Dк
	Dст - Dк

*в состав реагента входят: холестеринэстераза, холестериноксидаза, пероксидаза, 4-аминоантипирин, фенол, фосфатный буфер – рН 6.5.

** При проведении анализа лошадиной сыворотки следует помнить, что содержание холестерина в ней значительно ниже, чем в сыворотке крови человека.

Расчет результатов

С = • 4,65 ммоль/л

где 4,65 ммоль/л – концентрация холестерина в стандартном растворе.

Норма: 4,4 – 5,5 ммоль/л.

Выводы

Тестовые задания по теме: «β-Окисление высших жирных кислот и их биосинтез»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  В β-окислении жирных кислот участвуют ФАД - и НАД-зависимые дегидрогеназы.

2.  Полное окисление одной молекулы пальмитиновой кислоты до СО2 и Н2О сопровождается образованием 130 молекул АТФ.

3.  Линоленовая кислота является незаменимой для человека.

4.  Для образования мевалоновой кислоты необходим НАДФН (Н+).

5.  Простагландины образуются из полиненасыщенных жирных кислот.

6.  Холестерин в сыворотке крови находится только в свободном состоянии.

7.  Можно ли заменить НАДФН (Н+) на НАДН(Н+).в биосинтезе высших жирных кислот?

8.  Участвует ли биотин в биосинтезе жирных кислот?

9.  Возможно ли полное превращение нейтральных жиров в углеводы в животном организме?

10. Обратимы ли все стадии β-окисления жирных кислот в митохондриях?

11. Нужны ли витамины В2 и РР для нормального протекания - окисления жирных кислот?

12. Повышается ли с возрастом концентрация холестерина в сыворотке крови человека?

2) Выбрать один правильный ответ

Кофермент, участвующий в биосинтезе жирных кислот, но неучаствующий в их окислении: ФАД НАД НАДФН (Н+) КоА ТПФ

НАДФН (Н+) для биосинтеза жирных кислот и холестерина поставляется за счет: гликолиза ЦТК β-окисления жирных кислот биологического окисления пентозофосфатного пути

3) Установить последовательность образования метаболитов β-окисления жирных кислот

1 2 3 4 5

А. Еноил-КоА Б. Кетоацил-КоА В. Оксиацил-КоА Г. Ацил-КоА Д. Ацетил-КоА

5.4. Количественное определение малонового диальдегида

Свободными радикалами (R·) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновый диальдегид (МДА) – конечный продукт свободно-радикального окисления полиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА – химически очень активное вещество, своими альдегидными группами взаимодействует с NH2-группами белков, вызывая их необратимую денатурацию.

Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов – это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется также при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействии вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.

Цель работы

Определить содержание МДА в сыворотке крови

Принцип метода

МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой. При этом образуется окрашенное соединение - триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА исходя из молярного коэффициента экстинции триметилового комплекса.

Выполнение работы

Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0.2 мл 0.1% раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 минут при 0°С. МДА определяют в образовавшемся лизате по ниже приведённой схеме:

Реактивы и этапы	Пробы
Опыт	Контроль
Лизат, мл	0,5	–
Физиологический раствор, мл	1,5	2
Трихлоруксусная кислота (30% ТХУ), мл	2	2
Инкубируют 15 минут при 0°С
Центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочной жидкости и добавляют:
Тиобарбитуровая кислота (0,5%), мл	4	4
Кипятят 15 минут (осторожно!)
Охлаждают до 15–25 °С
Фотометрируют против воды (l=532 нм, толщина кюветы 1 см ) D532
Dоп – Dк

Расчет результатов

Концентрацию МДА (Cx) вычисляют по формуле:

Cx = 76,92 · (Dоп – Dк) мкмоль/л

Примечание: 76,92 – рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56 . 105 моль-1см-1) и разведения.

Выводы:

Тестовые задания по теме: «Обмен липидов»

1) Ответить на каждый вопрос однозначно: «да» или «нет»

1.  В организме животных встречаются в основном жирные кислоты с четным числом углеродных атомов.

2.  Фосфатидилхолин содержит остаток серина в составе своей молекулы.

3.  Карнитин осуществляет транспорт активированных жирных кислот в митохондрии.

4.  Желчные кислоты синтезируются в печени.

5.  В биосинтезе фосфатидилхолина участвует ЦТФ.

6.  В состав парных желчных кислот может входить глицин.

7.  Синтезируются ли в организме гормоны липидной природы?

8.  Велико ли содержание холестерина в хиломикронах?

9.  Может ли глицерин превращаться в диоксиацетонфосфат?

10. Нужен ли восстановленный НАДФН (Н+) для биосинтеза холестерина?

11. Является ли скавален циклическим соединением?

12. Может ли ацетон образоваться из ацетоуксусной кислоты?

13. Ацетил-КоА - единственный источник образования ацетоновых тел в организме.

14. Ацетоацетат является дополнительным источником энергии в клетках печени.

15. Донором метильных групп для синтеза фосфатидилхолина является метионин.

16. Ненасыщенные жирные кислоты синтезируются значительно быстрее, чем насыщенные.

17. НАДФН (Н+) является коферментом β-гидрокси-β-метилглутарил-КоА - редуктазы.

18. Энергетический выход полного окисления глюкозы меньше по сравнению с окислением капроновой кислоты.

19. Является ли фосфатидная кислота общим метаболитом в синтезе триацилглицеролов и фосфатидилхолина?

20. Активируется ли липаза жировой ткани цАМФ?

21. Являются ли пальмитоил-КоА и серин источником синтеза сфинголипидов?

22. Активирует ли адреналин липолиз в жировой ткани?