Дипломная работа на тему: "Морфологическая оценка эффективности комплексного лечения андрогенетической алопеции" (стр. 6 )

Пациенты основной группы наблюдения - 22 человека - получали курс инъекции аутологичной активированной PRP (AA-PRP). Пациенты контрольной группы - 22 человека - получали аппликации препарата миноксидила по стандартной методике.

2.2.Дизайн исследования

Проведено проспективное одноцентровое исследование.

Все пациенты находились под наблюдением 5 месяцев.

Курс инъекции аутологичной активированной PRP (AA-PRP) состоял их 4-х процедур, которые проводили с интервалом в 4 недели. Миноксидил пациентам контрольной группы наносили по стандартной методике - на сухую кожу волосистой части головы ежедневно, 2 раза в сутки, в количестве 1 мл, без последующего смывания, в течение 4-х месяцев. Пациенты основной группы получили 4 инъекции PRP с четырехнедельным интервалом между введениями. Забор материала для исследования проводили до начала лечения и через 4 месяца после начала лечения [; 2014]. У пациентов контрольной группы забор осуществлялся на фоне терапии миноксидилом, у пациентов основной группы – с интервалом 1 месяц после последней инъекции PRP.

2.3.Методика приготовления и использования обогащенной тромбоцитами плазмы

Плазму для инъекций приготовляли из цельной несвернувшейся крови, венопункция производилась в амбулаторных условиях непосредственно перед процедурой, которая осуществлялась в асептических условиях, при оптимальных температурных значениях (20-22°C).

Производили забор венозной крови пациента в количестве 18 мл в две стерильные тубы с 3.8% цитратом натрия в качестве антикоагулянта, в соотношении 1:9. Применяли метод двойного центрифугирования, использовалась центрифуга GLO GT416 с горизонтальным ротором и функцией «софт-старт». Кровь центрифугировали на скорости 1800 об/мин в течении 5 мин. Отделяли эритроцитарную массу и проводили второе центрифугирование плазмы на скорости 1800 об/мин в течении 10 мин. В качестве АА-PRP использовалось 2 мл нижней части супернатанта из каждой тубы. Забор обогащенной тромбоцитами плазмы проводили непосредственно в шприц для проведения инъекций, отделение бедной плазмы производилось вручную. В качестве активатора тромбоцитов использовался CaGl в соотношении 1:20 от объема полученной плазмы. Поверхность кожи головы обрабатывалась раствором хлоргексидина, местная анестезия не применялась. Интер-фолликулярные инъекции полученной АА-PRP производились папульной техникой на всю область поредения волос в объеме 0,05-0,1 мл/см2. Курс лечения состоял их 4-х процедур, с интервалом 4 недели.

2.4.Методы исследования

2.4.1.Клинические методы

Клинические методы включали визуальный осмотр пациента, оценку степени тяжести АГА по шкале Hamilton–Norwood (1975).

Рис. 1. Степени тяжести АГА по шкале Hamilton–Norwood (1975)

2.4.2.Лабораторное исследование

Всем пациентам проведен анализ крови на ТТГ, Т4 свободный, АКТГ, 17-ОН-Р, тестостерон общий, ГСПГ, эстрадиол, глюкозу, клинический анализ крови, в результате которого исследуемые показатели не выходили за рамки рефференсных значений.

2.4.3.Гистологическое и морфометрическое исследование

Биопсию кожи проводили под местной анестезией 1% раствором лидокаина с эпинефрином для достижения анальгезии и уменьшения кровотечения. Забор материала проводили панчем диаметром 4 мм (Stiefel Laboratories, Inc, Coral Gables, Fla; Hair Follicle Anatomy in Human Scalp Biopsies, D. A. Whiting, 2008). Получали 1 биоптат до лечения и 1 биоптат после лечения.

Из биоптата впоследствии готовили горизонтальные срезы. Для этого в соответствии с методикой Headington (1984) и Whiting (2003) проводили один горизонтальный(?) разрез на глубине около 1 мм ниже поверхности эпидермиса. Обе отрезанные стороны образца заливаются в кассете. Из второго биоптата готовили вертикальные срезы.

Для гистологического исследования кусочки кожи фиксировали в 10 % нейтральном формалине (рН 7,2), обезвоживали в спиртах возрастающей крепости и заливали в парафин по стандартной методике.

Оценка горизонтальных срезов.

При приготовлении поперечных срезов по мере того, как микротом делает более глубокие срезы блока, срезы становятся все более поверхностными с одного конца образца и более глубокими с другого.

Срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

При анализе горизонтальных срезов поэтапно проводили

•        Определение уровня среза

•        Определение фазы роста волоса

•        Подсчет волос в разных фазах и их соотношение

•        Определить наличие/отсутствие рубцовых изменений.

Для определения уровня срезов и фазы роста волос использовали методику, предложенную Miteva M. (A comprehensive approach to hair pathology of horizontal sections. Am J Dermatopathol. 2013 Jul;35(5):529-40).

Определение уровня

Уровень подкожной жировой клетчатки: в препарате волосяные фолликулы погружены на разную глубину.  Некоторые волосяные фолликулы характеризуются наличием формирующихся волос (напоминают сердцевину ромашки), другие волосяные фолликулы характеризуются наличием пигментированного центра за счет меланоцитов эпителия и пигментированных клеток матрикса волоса. В случае нерубцовых алопеций на этом уровне установить диагноз невозможно, за исключением гнездной алопеции – определяется воспалительный инфильтрат в форме
«роя пчел».

Уровень клубочков потовых желез: ему соответствует нижняя треть волосяного фолликула. В препарате срезы ВФ расположены хаотично, по форме напоминают бутоны крупных роз.  Срезы клубочков потовых желез
по форме напоминают гипсофил.

Уровень перешейка волоса: соответствует области выше мышцы, поднимающей волос, впадению протока СЖ. В препарате срезы ВФ и СЖ
«организованы» в сально-волосяные фолликулы (напоминает цветок лилии), разделенные волокнами сетчатого слоя дермы.

Уровень устья волосяного фолликула: устья 2-3 фолликулов и выводной проток СЖ сливаются (напоминают лицо с 2мя глазами и ртом). Стержень волоса может присутствовать или отсутствовать.

Определение фазы роста волоса Волосы в фазе анагена характеризуются наличием внутренней оболочки корня волоса и отсутствием некроза клеток. На уровне подкожной жировой клетчатки в клетках матрикса виден пигмент. На уровне потовых желез (нижняя треть ВФ) волосы в фазе анагена имеют округлую или эллиптическую форму, напоминающую цветок герберы. Толщина эпителия волосяного фолликула больше толщины стержня. Уровень потовых желез является основным уровнем для подсчета волос в фазе анагена, так как на уровне устья и перешейка ВФ происходит слияние соседних ВФ, подсчет затруднителен.

Волосы в фазе катагена подсчитываются вместе с телогеновым. Это короткая фаза «отдыха», характеризующаяся потерей волосяного матрикса и истончением эпителия кожных сосочков. В центре ВФ расположены кератиновые эозинофильные массы. Волосы в фазе телогена можно оценить ниже протока сальной железы по отсутствию внутренней оболочки корня волоса. Остатки внутренней оболочки состоят из нерегулярных звездчатых ороговевающих кератиноцитов. На ранних стадиях телогена ороговевание происходит не до конца, для позднего характерно полного ороговения. Характерен множественный апоптоз клеток.

Телогеновая герминативная единица - последняя стадия телогена, после отделения волоса.  Выглядит как нерегулярное скопление базалоидных звездчатых клеток в форме островков с ядрами, расположенными по периферии.

Фолликулы велюсных волос характеризуются наличием волос, в которых диаметр стержня волоса равен толщине внутренней оболочки фолликула или меньше ее, составляет ≤0.03 мм. Луковицы велюсных волос распознаются с трудом – слабо пигментированы.  Велюсные волосы расположены в средних и верхних отделах дермы. Обладают тонким волосяным влагалищем, в срезах напоминают бутон розы. Подсчитываются на уровне перешейка и устья ВФ.

Миниатюризированные волосы представляют собой анагеновые фолликулы размером менее 0,03 мм. Характерны для андрогенетической алопеции. Обладают толстым волосяным влагалищем, напоминают в срезах цветки опийного мака. Подсчитываются на уровне перешейка и устья ВФ.

Подсчет количества волос. Как правило, на верхнем уровне сосочкового слоя дермы имеется 35-40 волос, на уровне сетчатого слоя дермы их число уменьшается до 35, и на уровне ПЖК их число составляет 30. Верхний участок образца биопсии содержит волосы в фазе телогена, анагена, а также терминальные, велюсные и миниатюризированные волосы. На глубоких уровнях содержатся только терминальные волосы в фазе анагена.

Математический анализ результатов обследования

На каждого пациента была составлена формализированная карта, включающая сведения о возрасте пациента, давности анамнеза, сопутствующих заболеваниях, степени тяжести и стадии АГА, результатах обследований. Ввод, накопление, хранение и первичная сортировка данных исследования осуществлялись с использованием персонального компьютера и пакета прикладных программ «Excel», версия 14.0.

Статистическая обработка данных исследования осуществлялась с помощью пакета прикладных программ для статистической обработки данных Statistica for Windows (версия 10) и проводилась по этапам:

– анализ соответствия вида распределения количественных данных закону нормального распределения;

–математико-статистическое описание характеристик объектов исследования.

Статистическое описание объекта исследования в зависимости от вида их распределения включало:

– расчет средних значений показателей (M – среднего арифметического значения – для показателей, характеризующихся нормальным законом распределения, Me – медианы – в противном случае);

– определение характеристик изменчивости признаков (m – среднего квадратического отклонения – для показателей, характеризующихся нормальным законом распределения, Q1 и Q3 –  нижнего и верхнего квартилей – в противном случае);

– графическое представление результатов.

Характеристика обследованных пациентов

3.1.Длительность и степень тяжести АГА у пациентов групп наблюдения

Возраст пациентов в группах наблюдения варьировал 19 до 49 лет. Подавляющее большинство (81,8%) из них были в возрасте от 21 до 40 лет. Средний возраст пациентов основной группы был несколько больше, чем пациентов контрольной группы, однако это отличие было недостоверным (30,5±6,2 и 27,3 ±7,05 лет, соответственно, t=0,34, таблица 1).