Клинико-диагностическая характеристика целиакии у детей Иркутска и Иркутской области (стр. 7 )

2.2.2 Серологическая диагностика

Проводилась в лаборатории ИОДЦ. Для определения антител (IgA и IgG) к глиадину и тканевой трансглутаминазе используется иммуноферментный метод (ИФА), исследуется сыворотка крови. Исследование проводится на полностью автоматизированных анализаторах Alegria (Германия).

Принцип метода заключается в реакции антиген – антитело, где антигеном выступает гдиадин или тканевая трансглутаминаза. SMC-тест- система включает информацию о названии, сроках годности, изготовления и названия калибровочных кривых. Стрип состоит из 8 лунок, включающих контрольную сыворотку, конъюгату, ТМБ-субстрат. Каждый стрип предназначен для одного определения. При инкубации сыворотки присутствующие в образце антитела, связываются с антигеном, фиксированным на поверхности лунки, образовавшийся комплекс выявляется с помощью конъюгата, меченой ферментной меткой (пероксидазой хрена).

Добавление раствора ТМБ-субстрата приводит к изменению цвета, появляется синее окрашивание, коррелирующее с концентрацией комплекса антиген – антитело. Оптическая плотность измеряется при долине волны 650 нм. Расчет и интерпретация результатов выполняется автоматически (по калибровочным графикам). Каждый комплекс содержит контроль качества, который проводится так же автоматически.

2.2.3. Эндоскопическое исследование желудка и

двенадцатиперстной кишки

Эзофагогастродуоденоскопия проводилась стандартными методами в тех лечебных учреждениях, в которых находились пациенты. Эндоскопическое исследование в ИОДЦ проводилась с применением аппаратов японской фирмы “OLYMPUS”. Отдел оснащен электронными видеогастроскопами и видеоколоноскопами систем «EVIS-140», «EVIS -160 EXERA», «EVIS - 160A EXERA», «EVIS -160Z EXERA» с функцией оптического увеличения изображения в 115 раз для видеогастроскопа.

При ЭГДС производился забор биоптатов слизистой оболочки дистального отдела двенадцатиперстной и тощей кишки. Оценка состояния слизистой позволяет судить об активности воспалительного процесса. При целиакии преобладают явления атрофического и субатрофического дуоденита. Но в наших исследованиях подобные заключения звучали не часто, и описывалась как эндоскопическая норма. Возможно, это связано с тем, что не все дети проходили обследование во время манифестации заболевания, а так же недостаточен опыт эндоскопистов в работе с больными целиакией.

2.2.4. Морфологическое исследование биоптатов слизистой оболочки дистального отдела двенадцатиперстной кишки

И все же золотым стандартом является гистологическое исследование биоптатов слизистой оболочки тонкой кишки. Этот метод позволяет оценить состояние слизистой оболочки, определить степень выраженности структурных изменений, тем самым подтвердить диагноз целиакия, а при повторном исследовании оценить эффективность безглютеновой диеты.

У детей берется биоптат слизистой оболочки дистального отдела ДПК, проведение эндоскопа дистальнее связки Трейца очень болезненны и требуют обязательного анестезиологического пособия [40,59].

Для проведения полноценного гистологического и морфометрического исследования материал должен быть без повреждений. Любые повреждения

(фрагментация, сдавления) не позволяют достоверно оценить доставленный материал. Затруднить оценку состояния крипт, может наличие дуоденальных желез (бруннеровых), при взятии материала из слизистой оболочки ЛДПК. Взятый материал тщательно маркируется.

Для приготовления качественных гистологических срезов необходимо правильно ориентировать материал (в вертикальной плоскости). При неправильном срезе, невозможно будет судить о наличии или отсутствии атрофии ворсинок, или о морфометрической оценке вообще.

Именно с этим, чаще всего, вероятно, мы и сталкиваемся, из полученного материала в итоге невозможно провести морфометрической оценки.

Маркированный материал, помещался в емкость с фиксатором (10% раствор нейтрального формалина) на 24 часа. После фиксации биоптат заливают в парафин по общепринятой методике, затем приготавливались срезы толщиной 5-6 мкм, парафин затем удаляют ксилолом. Депарафинированные срезы для исследования окрашивались гематоксилином и эозином. Для выявления фиброза и определения степени его выраженности, проводилась окраска пикрофуксином и гематоксилином (по Ван Гизон). Бокаловидные клетки, слизь в просветах желез хорошо выявляется с помощью окрашивания альциановым синим. Для лучшей дифференцировки структурных компонентов слизистой оболочки, а так же для определения возможной бактериальной инвазии применялась окраска азуром и эозином (пропись Романовского-Гимзе).

Окрашенные препараты помещали в полистирол и покрывали покровными стеклами и исследовали в световом бинокулярном микроскопе.

Методы гистологического исследования.

1.Фиксация материала проводилась в забуференном нейтральном 10% растворе формалина.

2.Проводка материала осуществлялась в автомате для вакуумной проводки VIP-E150F фирмы “Sacura”, Япония.

3.Заливка в системе для автоматической заливки материала "TEC-IV" фирмы “Sacura”, Япония.

4.Срезы готовились на роторных микротомах CM-502 фирмы “Microm”, Германия с использованием одноразовых ножей.

5.Покраска срезов гистологическими и гистохимическими методиками осуществлялась в автомате для покраски срезов “Prisma” фирмы “Sacura”, Япония.

6.Покрытие срезов на предметных стеклах специальной пленкой проводилась в автомате “Film” фирмы “Sacura”, Япония.

7.Микроскопическое морфометрическое исследование препаратов поводилось с помощью компьютерной микроскопической видеосистемы “Quantimet 550IW” фирмы “Leica”, Англия, для цифрового анализа патоморфологического и цитологического материала и углубленной диагностики с камерой высокого разрешения, позволяющей проводить количественный анализ изображения по реальным цветам или оптическим плотностям с форматом изображения 6000х4000 пикселей.

Использованные гистологические, гистохимические окраски.

1.Гематоксилин-эозин.

2.Пикрофуксин по Ван Гизону.

3.PAS-реакция (ШИК-реакция, окраска реактивом Шиффа).

4.ФВГ (фосфорно-вольфрамовый гематоксилин).

При морфометрическом исследовании определялись (в мкм):

толщина слизистой оболочки, длина ворсинки, толщина ворсинки, глубина крипт, ширина крипт. Подсчитывалось соотношение «средняя длина ворсинки: средняя глубина крипт», «средняя длина ворсинки: средняя толщина ворсинки». При обследовании обращалось внимание на наличие ворсинок измененной формы, утолщенных участков вместо ворсин. В собственной пластинке слизистой оболочки подсчитывалось количество лимфоцитов, плазматических клеток, эозинофильных лейкоцитов, нейтрофильных лейкоцитов, клеток стромы с последующим вычислением средних показателей и пересчетом на стандартную площадь 1 мм².

Подсчет количества межэпителиальных лимфоцитов и бокаловидных клеток проводился по всей поверхности ворсинок и крипт с последующим пересчетом на стандартную единицу длины поверхности.

Обращалось внимание на состояние собственной пластинки слизистой оболочки: оценивалась степень выраженности полнокровия сосудов, лимфатических сосудов, наличие или отсутствие кровоизлияний, наличие фиброза.

Морфологические и морфометрические исследования проводились под руководством заведующего отделением патоморфологии и цитологии ИОДЦ, к. м.н.

2.2.5. Статистические методы исследования

Расчет репрезентативности:

Получение исходных материалов и их репрезентативность, обеспечивалось за счет предварительного планирования исследования [20]. Для определения объема выборочной совокупности обследованного контингента была использована формула (1974):

t² pq

n = , где

m²

n - численность выборочной совокупности

t – доверительный коэффициент

p - величина показателя, (распространенность 1:1000)

q – величина, обратная показаp)

m – предельная ошибка выборки

По данным литературы средняя распространенность целиакии в Европе 1:300. Таким образом, подставив известные значения в формулу, получаем:

2² · 3,3 · (1000-3,3)

n = = 3289,1

2²

Для получения репрезентативных данных в ходе работы необходимо было обследовать 3300 человек. Для обеспечения надежности результатов с вероятностью 95% доверительный коэффициент взят равным 2 (t=2), что считается достаточным для медико-биологических исследований. Размер предельной ошибки составил 2%.

С целью оценки распространенности целиакии проводилось анкетирование родителей детей, посещающих детские дошкольные учреждения (2045 человек) и неорганизованных детей (1485 человек), всего 3530 человек. Дети взяты с 4 педиатрических участков( 3 участка в городских поликлиниках – 2710 человек и 1 участок в Усть-Ордынском бурятском национальном округе - 820 человек).

Анкетирование проводилось с использованием таблиц диагностических маркеров целиакии, предложенных (2005г), (приложение 2) в нашей модификации.

У родителей выяснялись проявления заболевания, отмечаемые на протяжении последних 3 месяцев и более, с дальнейшим суммированием

показателей. При сумме баллов 27 и более ребенок направлялся на углубленное обследование для исключения целиакии.

Результаты исследований фиксировались в электронных таблицах MS Еxcel 2000, была сформирована база данных, на основе которой проводился статистический анализ.

Статистический анализ полученных результатов проводился с помощью пакета прикладных программ MS Еxcel for Windows, Statistica г.) и Statistica 10 (лицензионное соглашение ВХ 103 У 909731 FAC). Применялись общепринятые методы вариационной статистики.

При анализе качественных признаков проводилась оценка относительной частоты признака (распространенность) Р, доверительный интервал (95% ДИ). При выборке до 10 наблюдений и значениях относительной величины 0 или 100% вводилась поправка Йейтса. При проверке нулевой гипотезы о равенстве долей применялся z-критерий, хи-квадрат ().

При анализе количественных признаков проводился расчет средней арифметической (М), стандартного отклонения, медианы (Ме) и интерквартильного размаха (25 и 75 – го процентилей), для определения различия между средними величинами t-критерий. При проведении сравнений двух независимых выборок применялся непараметрический U-критерий Манна-Уитни.

Критический уровень значимости, при проверке статистических гипотез о существовании различий между группами р, принят равным 0,05.

Все исследования проводились при информированном согласии родителей пациентов.

ГЛАВА 3

РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ ЦЕЛИАКИИ СРЕДИ ДЕТЕЙ ИРКУТСКА И ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ ПО РЕЗУЛЬТАТАМ КЛИНИКО-АНАМНЕСТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Результаты анкетирования для выявления симптомов целиакии

С целью оценки частоты выявления целиакии среди детского населения г. Иркутска и Иркутской области проведено проспективное клинико-анамнестическое исследование.

Для определения репрезентативности выборки была использована формула , на основании которой мы определили объем выборочной совокупности – не менее 3300человек.

Что бы выборка соответствовала по своим характеристикам исследуемой популяции, для обследования взяты пациенты с 3 педиатрических участков, находящихся на территории двух районных поликлиник, в разных микрорайонах города, всего 2710 человек, из них мальчики 52,4% (n=1420), девочки 47,6% (n=1290). Еще 1 участок взят в Усть-Ордынском бурятском национальном округе, в месте компактного проживания коренного населения (бурятчеловек, из них мальчики составили 52,2% (n=428), девочки – 47,8% (n=392).

Всего было обследовано 3530 человек, из них мальчики 52,4% (n = 1848), девочки - 47,6% (n = 1682). Половая структура опрошенных детей в зависимости от места их проживания г. Иркутск, Усть-Ордынский бурятский национальный округ, указана на рисунке 3.1.

Рисунок 3.1 Половая структура опрошенных детей в зависимости от места проживания.

Для оценки частоты выявления целиакии проводилось анкетирование среди родителей, дети которых посещают детские дошкольные учреждения человек (57,9%) и неорганизованные дети 1485 человек (42,1%). Процент организованных детей достоверно выше (z=9,5, p<0,001). Возраст детей от 1 до 8 лет.

Анкетирование проводилось с использованием таблиц диагностических маркеров целиакии, предложенных (2005г), (приложение 2) в нашей модификации.

По результатам анкетирования родителей симптомы, характерные для целиакии, выявлены со следующей частотой: боли в животе отмечались у 15,6% детей [95%ДИ 14,4;16,8], изменения стула у 15,01% [95%ДИ 13,9;16,2]. Снижение аппетита отмечалось у 21,02% [95%ДИ 19,7;22,4], дефицит массы тела (ДМТ) был выявлен у 22,7% детей [95%ДИ 21,3;24,1]. В 7,31% [95%ДИ 6,5;8,2] отмечалась задержка роста (ЗР). Часто болеющие дети (ЧБД) составили 19,04% [95%ДИ 17,8;20,4], дети с различными аллергическими проявлениями составили 28,27% [95%ДИ 26,8;29,8]. Так же 32,69% родителей [95%ДИ 31.1;34.2] отмечали агрессивность и раздражительность у детей (рис.3.2).

Рисунок 3.2 Частота выявления симптомов ассоциированных с целиакией

Самое большое количество детей с задержкой роста 17,4% и массы тела 32% было отмечено в детских садах, находящихся в микрорайоне, основной контингент которого люди с низким материальным достатком, большое количество неблагополучных семей (соответственно z=8,6, p<0,001 и z=5,5, p<0,001).

По результатам анкетирования (сумма баллов по анкете 27 и более) и общего осмотра 137 детей (3,9% от общего числа участвовавших в анкетировании) было отобрано для дополнительного обследования. Для обследования выдавалось направление участковыми педиатрами с информированного согласия родителей (бесплатно). При этом была одна семья, которая отказалась от обследования ребенка.

Дети были направлены на серологический скрининг. Из 137 детей у 33 человек (24,1% от числа детей направленных на серологическое исследование и 0,9% от числа опрошенных детей) были выявлены положительные серологические маркеры целиакии, из них 54,5% мальчиков (n=18) и 45,5% девочки (n=15) (таблица 3.1).

Таблица 3.1

Поло – возрастная структура детей с положительными серологическими маркерами целиакии.

Возрастная группа	Количество детей с положительными серологическими маркерами (n)	Доля детей с положительными серологическими маркерами в возрастной группе (%)	р
все	муж	жен	все	муж	жен
<1 г (n=6)	3	2	1	50	33,3	16,7
1-2 г (n=14)	8	4	4	57,1	28,6	28,6	<0.05
2-3 г (n=9)	1	1	0	11,1	11,1	-
3-4 г (n=21)	7	2	5	33,3	9,5	23,8
4-5 г (n=23)	5	1	4	21,7	4,3	17,4
5-6 г (n=32)	7	6	1	21,9	18,8	3,1
6-7 г (n=14)	0	0	0	-	-	-	-
7-8 г (n=18)	2	2	0	11,1	11,1	-
Всего (n=137)	33	18	15	24,1	13,1	10,9

Примечание. Р – различия количества серопозитивных детей в возрастной группе к количеству серопозитивных пациентов в целом в выборке (критерий ).