Малый практикум по микробиологии (стр. 14 )

Вопросы:

1.  В чем заключаются особенности морфологии, цикла развития и типа питания миксомицетов?

2.  Какие классы истинных грибов знаете?

3.  Каковы особенности морфологии мицелиальных грибов?

4.  Тип питания и способы размножения мицелиальных грибов.

5.  Экологические группы грибов.

6.  К каким классам грибов относят дрожжи?

7.  Морфология и способы размножения дрожжей.

8.  Промышленное значение дрожжей.

ТЕМА 8. МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ

Занятие 8

Цель занятия: знакомство с принципами и методами стерилизации; с устройством и работой аппаратов и приборов, используемых для стерилизации. Освоение правил приготовления микробиологической посуды, инструментов, материалов к стерилизации.

Стерилизация (от лат. «sterilities» - бесплодный) – это полное уничтожение микроорганизмов (вегетативных клеток и спор) в объектах внешней среды. Микробиологи стерилизуют питательные среды, микробиологическую посуду, инструменты и другие необходимые предметы с целью не допустить развития посторонних микроорганизмов в исследуемых культурах.

Для стерилизации используют физические и химические методы.

Физические методы стерилизации

Термическая обработка применима лишь в отношении термоустойчивых материалов. Существуют различные варианты высокотемпературной обработки.

Прокаливание

Прокаливание (фламбирование) в пламени спиртовки используют для стерилизации бактериальной петли (иглы), скальпеля, пинцета и других металлических предметов. При прокаливании необходимо помнить, что наивысшая температура развивается в верхней и периферической частях пламени (рис. 35).

Рис. 35. Значение температуры (в OС)

в разных участках пламени спиртовки

Стерилизация сухим жаром

Стерилизацию сухим жаром проводят в сухожаровых шкафах при температуре 160 °С в течение 2 часов. Метод позволяет эффективно уничтожать не только вегетативные клетки (погибают в течение нескольких минут), но и споры микроорганизмов (необходима экспозиция в течение 2 часов). Высокотемпературный сухой воздух разрушает структуру большинства органических соединений и ведет к значительному испарению жидкости. Поэтому этот метод пригоден для стерилизации ограниченного круга объектов: изделий из стекла (чашки Петри, пипетки, шпатели, пробирки, колбы и т. д.) и других термостойких материалов, безводных гидрофобных порошков.

Стерилизация текучим паром

Стерилизация текучим паром (автоклавирование) включает обработку влажным паром под давлением. Насыщенный водяной пар под давлением обладает высокими биоцидными свойствами, при этом не повреждает большинство стерилизуемых материалов. Метод очень эффективен для стерилизации термостабильных жидких и плотных питательных сред, других жидкостей. Также в автоклавах стерилизуют стеклянную посуду, изделия из металла, термостойкой пластмассы и резины, перевязочный и шовный материал. Исключение составляют термолабильные материалы. При автоклавировании погибают и вегетативные клетки, и споры. В зависимости от стерилизуемых объектов температуру пара устанавливают от 110 до 138 °С, давление – от 0,5 до 2,5 атм., экспозиция – от 15 до 60 мин. Например, такие легко разрушающиеся субстраты, как молоко, желатиновые среды, а также субстраты, содержащие сахара, витамины (среды Гисса, дрожжевой автолизат, пивное сусло и т. д.) стерилизуют при 0,5 атм. в течение 30 мин. Мясо-пептонные среды автоклавируют при 1 атм. 30 мин., почвенный агар при 1,5 атм. 30 мин.

Устройство автоклава. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление (рис. 36). Его внутренняя часть является стерилизационной камерой (1). В нее помещают стерилизуемый материал. Стерилизационная камера снабжена краном (2) для выхода воздуха, манометром (3) для определения давления пара, предохранительным клапаном (4) для выхода пара при повышении давления. Пространство между стенками (5), называемое водопаровой камерой, заполняется через воронку (6) водой до определенного уровня, который отмечен на специальной водомерной трубке автоклава (7). В верхней части внутренней стенки водопаровой камеры имеются отверстия (8), через которые пар поступает в стерилизационную камеру. Паровой котел сверху закрыт кожухом (9). Он предохраняет котел от механических повреждений, а работающих около автоклава – от ожогов. Для создания герметичности автоклав плотно закрывается массивной крышкой (10) с резиновой прокладкой.

Рис. 36. Схема автоклава

Процесс стерилизации. В водопаровую камеру наливают воду. В стерилизационную камеру на специальную решетку (11) помещают стерилизуемый материал. Питательные среды стерилизуют в пробирках, колбах, матрацах или бутылях. Объем питательной среды не должен превышать ½ высоты сосуда, чтобы предотвратить смачивание пробок во время кипения среды. Сосуды со средами должны быть закрыты ватно-марлевыми пробками, которые сверху прикрываются бумажными колпаками. Стеклянная посуда (чашки Петри, пробирки, пипетки и т. д.), металлические инструменты (скальпели, пинцеты и т. д.) должны быть завернуты соответствующим образом в бумагу для предотвращения контаминации микрофлорой окружающей среды. Загрузив стерилизационную камеру, плотно закрывают и завинчивают крышку автоклава. Затем открывают кран, соединяющий стерилизационную камеру с наружным воздухом, и включают нагрев. Нагревание воды в водопроводной камере осуществляется с помощью вмонтированных в неё электродов и регулируется автоматически. После начала парообразования удаляют воздух из стерилизационной камеры путем вытеснения воздуха паром через кран (2) для выхода воздуха. Процесс продувания длится 15–20 мин. Когда воздух вытеснен, закрывают пароотводной кран, и давление пара доводят до показания, соответствующего режиму стерилизации, с этого момента начинается собственно процесс стерилизации. Это давление поддерживается путем регулирования подогрева. По окончании времени стерилизации выключают нагрев автоклава. После этого необходимо дождаться, когда давление в автоклаве сравняется с атмосферным, затем открывают кран, выводящий пар. Когда пар выйдет, медленно открывают крышку автоклава.

Тиндализация

Тиндализация – этот метод дробной стерилизации применяется для стерилизации сред, содержащих термолабильные компоненты (разрушающиеся при температуре выше 100 °С). Метод предложен английским ученым Тиндалем в 1877 г. Тиндализация включает ежедневное прогревание сред при 56–58 – 100 °С в течение 3–4 – 5–6 суток (выбор режима стерилизации определяется составом питательной среды). Такая температура губительна для вегетативных клеток, но не достаточна для инактивации бактериальных эндоспор. В промежутке между прогреваниями среды помещают на сутки в термостат (30°С) для проращивания спор. Предполагается, что прорастающие из спор клетки погибают при последующем прогревании. Прогревание можно осуществлять в парах кипящей воды (текучим паром), т. е. при 100 °С, в автоклаве с незавинченной крышкой 3–4 раза по 20–40 мин., в кипятильнике Коха или на водяной бане с хорошо пригнанной крышкой.

Облучение

Облучение электромагнитными волнами разной длины используют для стерилизации термолабильных материалов.

Ультрафиолетовые лучи (УФЛ). Микробоцидное действие характерно для коротковолновых УФЛ, особенно длиной 250–270 нм, используемых в бактерицидных лампах. УФЛ воздействуют на нуклеиновые кислоты, в результате чего происходит разрыв водородных связей и образование пиримидиновых димеров (Т-Т, Т-С, С-С) в ДНК, что приводит к появлению нежизнеспособных мутантов. Ультрафиолетовое облучение не обеспечивает полного уничтожения микроорганизмов, особенно их споровых форм. К УФЛ в большей степени чувствительны вегетативные клетки, устойчивы микобактерии и стафилококки. Поэтому в полной степени ультрафиолетовое облучение к методам стерилизации нельзя отнести. УФЛ используют для дезинфекции воздуха помещений.

γ- и рентгеновское излучение используется для стерилизации пластмасс, но требует строго соблюдения правил безопасности.

Стерилизация фильтрованием

Стерилизация фильтрованием используется для субстратов, не выдерживающих нагревания, в частности для сред и растворов, содержащих термолабильные белки, витамины, сахара, некоторые антибиотики, а также для сывороток, летучих веществ. Способ заключается в пропускании жидкостей через специальные мелкопористые фильтры, называемые бактериальными. Бактериальные фильтры изготавливаются из разных материалов, различаются по форме и диаметру пор. Мембранные (коллоидные) фильтры готовят на основе нитроцеллюлозы. Они представляют собой диски разного диаметра толщиной 0,1–0,5 мм. Диаметр пор в зависимости от номера фильтра от 0,01 до 5 мкм. Мембранные фильтры задерживают микроорганизмы благодаря малым размерам пор. Мембранные фильтры, имеющие диаметр пор 0,1 мкм и меньше, называют ультрафильтрами. Их используют для фильтрации вирусов и высокомолекулярных белков. Асбестовые фильтры известны под названием фильтров Зейтца (рис. 37). Их изготавливают из смеси асбеста с целлюлозой в виде больших плотных листов толщиной 4–6 мм, которые затем разрезают на диски или квадраты разной величины. На пористость фильтров указывают обозначения, имеющиеся на пластинах: индекс ЕКП соответствует диаметру пор 0,8–1, ЕКS-1 – 1–1,2 мкм и т. д. Фарфоровые фильтры впервые были предложены Пастером и Шамберланом. Впоследствии они получили название «свечи Шамберлана». Их изготовляют из смеси кварцевого песка и каолина, прокаленных на огне. Они имеют вид полого цилиндра, закрытого на одном конце (рис. 38). Свечи Шамберлана имеют положительный заряд. Диаметр пор – от 1,2 до 9 мкм. Фильтры из стекла представляют собой двухслойные диски, изготавливаемые из фрагментов стекла «Пирекс» путем их сплавления. По пористости пластинки разделяют на три типа: Р – диаметр пор меньше 1, М – от 1 до 1,7, С – больше 1,7 мкм.