Малый практикум по микробиологии (стр. 1 )

Федеральное агентство по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Иркутский государственный университет»

, ,

МАЛЫЙ ПРАКТИКУМ ПО МИКРОБИОЛОГИИ

Учебно-методическое пособие

Иркутск 2009

УДК 579(076.5)

ББК 28.4я73

В-99

Печатается по решению редакционно-издательского совета Иркутского государственного университета

, , Жилкина практикум по микробиологии: Учеб.-метод. пособие для студ. высш. учеб. заведений по специальностям «Микробиология», «Биология» и «Физиология».

В учебно-методическом пособии изложены методы исследования микроорганизмов с использованием световой и электронной микроскопии, приемы приготовления нативных и фиксированных препаратов клеток, способы их окрашивания. Приводятся принципы составления питательных сред и их классификация, условия культивирования микроорганизмов и методы стерилизации, используемые в микробиологической практике. Рассматриваются прямые и косвенные методы количественного учета микроорганизмов, способы получения чистых культур, принципы идентификации прокариот.

Пособие предназначено для студентов высших учебных заведений, обучающихся по специальностям «Микробиология», «Биология» и «Физиология».

Научный редактор: докт. биол. наук, проф.

Рецензенты: докт. биол. наук, проф.

(Лимнологический институт СО РАН),

канд. биол. наук., доц.

(ГОУ ВПО Иркутский государственный университет)

ПРЕДИСЛОВИЕ

Учебно-методическое пособие предназначено для студентов III курса специальностей «Микробиология», «Биология» и «Физиология», слушающих теоретический курс и выполняющих практические занятия по микробиологии.

Пособие дает возможность овладеть основными приемами работы с микроорганизмами, методами приготовления и окраски микроскопических препаратов, техникой посевов и выделения чистых культур. В процессе работы студенты знакомятся со строением клетки прокариот, их морфологическим разнообразием, с морфологией и способами размножения микромицетов и дрожжей, с принципами составления питательных сред и условиями культивирования микроорганизмов. При рассмотрении методов стерилизации студенты изучают устройство и принцип работы автоклава, сушильного шкафа, осваивают правила приготовления микробиологической посуды, инструментов, питательных сред к стерилизации. В процессе идентификации бактериальных штаммов до уровня рода, исследуют их морфологические, тинкториальные, культуральные и физиолого-биохимические свойства. Овладевают прямыми методами количественного учета микроорганизмов. Для освоения метода Коха студенты проводят микробиологический анализ почвы. В ходе выполнения этой практической задачи также устанавливают класс разнообразия микроорганизмов в исследуемом образце почвы.

Для полноценного усвоения материала каждое занятие включает теоретические сведения по изучаемой теме и методы, необходимые для проведения практических исследований, а также контрольные вопросы.

При подготовке пособия были использованы материалы, приведенные в «Руководстве к практическим занятиям по микробиологии» (под ред. , 1983, 1995) и «Практикуме по микробиологии» (под ред. , 2005). Авторы данного учебно-методического пособия придерживались тематического плана занятий, разработанного доцентом кафедры микробиологии ИГУ в «Методических рекомендациях к практическим занятиям по микробиологии» (1981).

ТЕМА 1. ПРАВИЛА И ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ. МИКРОСКОПИЯ

Занятие 1

Цель занятия: знакомство с микробиологической лабораторией, правилами и техникой безопасности при работе. Изучение устройства светового микроскопа, освоение техники микроскопии, особенностей работы с иммерсионной системой.

В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры. Чистой называют культуру, содержащую микроорганизмы одного вида. Ввиду того, что в воздухе и на поверхности предметов, на инструментах, а также на одежде человека, его руках, волосах и т. д. всегда имеется большое количество разнообразных микроорганизмов, следует постоянно заботиться о сохранении чистоты изучаемых культур. Требование чистоты культуры в значительной степени определяет специфику устройства микробиологической лаборатории и правила работы микробиолога.

Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Под лабораторные комнаты отводят наиболее светлые, просторные помещения, естественное освещение которых должно составлять не менее 110 лк. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом – пластиком или линолеумом, а стены на высоту 170 см от пола окрашивают в светлые тона масляной краской. Основное рабочее помещение оборудовано столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения аппаратуры, посуды и реактивов.

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещены автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, помещение для хранения культур и т. д. Бокс служит для пересевов микроорганизмов и представляет собой небольшую изолированную комнату, разделенную перегородкой на две части. Оборудование бокса состоит из бактерицидной лампы, смонтированной на потолке бокса, стола и стула.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе

Микробиологическую лабораторию необходимо содержать в чистоте. В ней не должно быть лишних предметов. Следует регулярно проводить гигиеническую уборку лабораторных помещений. Пол, стены и мебель обрабатывают пылесосом и протирают растворами различных дезинфицирующих веществ. В качестве дезинфицирующих растворов чаще всего пользуются 3 – 5%-ным раствором карболовой кислоты или лизола, 0,5 – 3%-ным водным раствором хлорамина и некоторыми другими дезинфектантами.

Для дезинфекции воздуха эффективно облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной от 200 до 400 нм, которые обладают высокой антимикробной активностью. В качестве источника ультрафиолетового излучения используют бактерицидные лампы. Излучателем в них служит электрическая дуга, возникающая в парах ртути низкого давления. Более 80 % испускаемого ими спектра приходится на волны длиной 254 нм. В зависимости от степени загрязнения воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 мин. до нескольких часов. Ультрафиолетовые лучи могут вызывать тяжелые поражения глаз, поэтому при работе с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные лучи не попадали в глаза. Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки. Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. С этой целью используют растворы лизола, хлорамина, 70%-ные растворы изопропилового или этилового спиртов. Поверхность стола можно дезинфицировать и ультрафиолетовыми лучами.

Правила и техника безопасности при работе в микробиологической лаборатории

1. В лаборатории следует работать в халатах.

2. В помещении лаборатории запрещается хранить посторонние вещи, принимать пищу, курить.

3. В лаборатории и боксе нельзя находиться при включенной бактерицидной лампе.

4. Недопустимо зажигать одну спиртовку от другой, следует использовать спички.

5. Все манипуляции с культурами микроорганизмов (посевы, приготовление микроскопических препаратов и т. д.) необходимо выполнять осторожно, не допуская образования микробных аэрозолей.

6. Микробная масса не должна загрязнять руки, стол и окружающие предметы. Пролившуюся микробную взвесь обезвреживают, используя дезинфицирующие средства.

7. После окончания работы культуры сдают преподавателю, засеянные пробирки и чашки ставят в термостат.

8. Бактериологические петли, иглы, пинцеты и другие металлические предметы после соприкосновения с микроорганизмами прожигают в пламени спиртовки и ставят в специальный штатив.

9. Использованные предметные и покровные стекла, пипетки, шпатели и т. д. помещают в 3–5%-ный раствор карболовой кислоты или другие дезинфицирующие растворы.

10. Отработанные культуры в пробирках, чашках Петри и т. д. обезвреживают при помощи дезинфицирующих растворов в течение суток, затем посуду кипятят и моют.

11. Следует строго соблюдать личную гигиену – после окончания работы необходимо тщательно вымыть руки с мылом.

12. Необходимо соблюдать технику безопасности при работе с электроприборами и химическими реактивами.

Устройство светового микроскопа

Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется микрометрами, возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз.

Наиболее распространенной моделью микроскопов биологических рабочих являются микроскопы серии «Биолам». Микроскоп имеет механическую и оптическую части (рис. 1).

Рис. 1. Устройство микроскопа «Биолам Р-11»:

1 - окуляр, 2 - тубус, 3 - тубусодержатель, 4 – рукоятка макрометрического

винта, 5 – рукоятка микрометрического винта, 6 – основание микроскопа, 7 - зеркало,

8 - конденсор, ирисовая диафрагма и светофильтр, 9 - предметный столик, 10 - объективы

Механическая часть микроскопа включает штатив с предметным столиком и тубус. На поверхности столика имеются две клеммы, зажимающие препарат. Под предметным столиком на штативе укреплен кронштейн конденсора, который может перемещаться вертикально в пределах 20 мм специальным винтом, расположенным справа. Конденсор крепится в гильзе винтом, находящимся с передней стороны кольца кронштейна.

Верхняя часть штатива – тубусодержатель – может перемещаться на 50 мм с помощью механизма, смонтированного в основании штатива. Этот механизм приводится в действие вращением макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и тонкой фокусировки препаратов, соответственно. При вращении этих винтов по часовой стрелке тубусодержатель опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается.