Малый практикум по микробиологии (стр. 18 )

Хемотаксономические признаки. Хемотаксономией называют классификацию организмов на основе особенностей химического состава клеток. Хемотаксономия включает:

·  Изучение компонентов клеточной стенки: состав и структуру пептидогликана, тейхоевых и тейхуроновых кислот (у грамположительных бактерий), липополисахарида (у грамотрицательных бактерий), наличие миколовых кислот и т. д.

·  Изучение компонентов ЦПМ: определение липидного и жирнокислотного состава, аминокислотных последовательностей цитохромов, состава хинонов, наличия каротиноидов, бактериохлорофиллов, других порфиринов.

·  Исследование белкового состава клеток (белковая таксономия). Изучают мембранные и рибосомные белки, суммарный состав клеточных белков.

Геномные характеристики штаммов и видов. Геносистематика основана на анализе нуклеиновых кислот. Геномы различных бактерий сравнивают по их размерам, по нуклеотидному составу (молярная доля гуанина и цитозина (GC) в ДНК, %), по степени гибридизации ДНК. Также для классификации бактерий используют анализ нуклеотидных последовательностей рРНК (16S-, 23S-рРНК).

Занятие 10

Определение чистоты идентифицируемой бактерии, изучение ее морфологических и тинкториальных свойств

Задание 1. Проверить культуру на чистоту с использованием двух методов:

1.  Визуальный. Просматривают характер роста культуры на скошенном РПА. У чистой культуры рост должен быть однородным.

2.  Микроскопирование культуры. Готовят фиксированный окрашенный препарат, просматривают под микроскопом, используя иммерсионный объектив с увеличением 90×. Определяют морфологическую однородность культуры.

Задание 2. Определить форму клеток, характер их соединения, установить наличие или отсутствие подвижности.

Для исследований необходима односуточная культура. Для определения формы клеток, характера соединения их в агрегаты используют препарат «раздавленная капля» и фиксированный окрашенный препарат (см. Занятие 2). Для определения подвижности готовят препарат «раздавленная капля». Препараты просматривают под микроскопом, используя иммерсионный объектив с увеличением 90×, зарисовывают микроскопическую картину.

Задание 3. Измерить величину бактериальной клетки.

Готовят фиксированный окрашенный препарат односуточной культуры. Для определения размеров клеток используют окулярный винтовой микрометр МОВ-1-15, который закрепляют на тубусе микроскопа, предварительно вынув окуляр (рис. 41). В окуляре винтового микрометра имеется неподвижная шкала с ценой деления 1 мм для определения размеров крупных объектов и подвижная стеклянная пластинка с перекрестием для определения размеров бактерий. Пластинка связана с микрометрическим винтом-барабаном и перемешается вместе с перекрестием при его вращении. Для измерения длины клетки перекрестие при помощи винта-барабана подводят к одному концу клетки и отмечают деление на барабане. Затем, вращая барабан, перемещают перекрестие до другого конца клетки и вновь отмечают деление на барабане. Определяют, скольким делениям микрометрического винта-барабана соответствует длина клетки, и умножают полученное значение на цену деления барабана при данном увеличении микроскопа.

Рис. 41. Винтовой окулярный микрометр:

1 – корпус, 2 – отсчетный барабан. 3 – окуляр с диоптрийной наводкой,

4 – винт для креплении я на тубусе микроскопа, 5 – вид под микроскопом

Цену деления барабана определяют с помощью объективного микрометра (рис. 42). Объективный микрометр – это металлическая пластинка с отверстием в центре. В отверстие вставлено стекло, на которое нанесена линейка длиной 1 мм. Она разделена на 100 частей, т. е. одно деление линейки составляет 0,01 мм, или 10 мкм. Объективный микрометр помещают на предметный столик микроскопа и фокусируют при малом увеличении. Изображение линейки помещают в центр поля зрения, и устанавливают объектив с увеличением 90×. Затем подводят перекрестие к началу одного деления линейки объективного микрометра и отмечают деление на барабане. Вращая барабан, перемещают перекрестие до конца деления линейки, и вновь отмечают деление на барабане. Определяют скольким делениям винта-барабана соответствует одно деление объективного микрометра. Например, одно деление линейки объективного микрометра, т. е. 10 мкм соответствует X делениям микрометрического винта-барабана, следовательно, одно его деление при данном увеличении микроскопа равно 10 : X мкм.

Рис. 42. Объективный микрометр: 1 – общий вид, 2 – вид под микроскопом

Чтобы результаты были достоверными, измеряют не менее 20 клеток. При определении размеров клеток округлой формы измеряют диаметр клеток, у палочковидных форм – длину и ширину.

Данные подвергают статистической обработке. Вычисляют средние величины длины и ширины клеток (или диаметра):

(1)

Находят среднее квадратичное отклонение, приходящееся на одно измерение:

(2)

Определяют среднюю квадратичную ошибку среднего арифметического:

(3)

где Xi – любая варианта; Xср. – среднее арифметическое, n – количество измерений.

Задание 4. Определить наличие эндоспор.

Наличие эндоспор определяют по методу Пешкова, используя 7-ми суточную культуру (см. Занятие 4). Определить тип спорообразования и характер расположения спор в клетке.

Задание 5. Окрасить исследуемую культуру по Граму.

Для окраски бактерий по Граму использовать методику, приведенную выше (см. Занятие 3).

Материалы и оборудование. Микроскоп, объективный микрометр, окулярный винтовой микрометр, спиртовка, предметные и покровные стекла, бактериологическая петля, пинцет, стерильная вода в пробирках, стерильные пипетки на 1 мл, кристаллизатор, колба с водой, генциан фиолетовый, фуксин, метиленовый синий, нейтральный красный, раствор Люголя, стаканчики с 96°-ным спиртом, иммерсионное масло, хлопчатобумажная салфетка, фильтровальная бумага, дезинфицирующий раствор.

Вопросы:

1.  Какие разделы включает систематика бактерий?

2.  Каким образом осуществляется образование и употребление научных названий бактерий?

3.  Дать определение понятиям «штамм», «типовой штамм», «вариант», «вид».

4.  Морфологические, тинкториальные и культуральные признаки, используемые для идентификации бактерий.

5.  Физиолого-биохимические свойства бактерий.

6.  Использование серологических и хемотаксономических признаков для идентификации бактерий.

7.  На чем основана геносистематика бактерий?

8.  Что такое чистая культура? Какими способами проверяют культуру на чистоту?

ТЕМА 10. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

Занятие 11

Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств идентифицируемой бактерии

Культуральные свойства изучают при росте бактерий на плотных и жидких питательных средах.

На поверхности плотных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колонии, штриха или сплошного газона. Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросшее из одной клетки. В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной среды, в ее толще или на дне чашки Петри) различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотной среде являются колонии, выросшие на поверхности среды.

Рост бактерий в жидкой питательной среде сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка.

Характеристика физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов включает описание способности расти на разных питательных средах и вызывать определенные превращения веществ, входящих в состав этих сред. Чаще всего учитывают использование различных соединений углерода и азота, ферментативную активность, отношение к кислороду.

Использование соединений углерода. В конструктивном метаболизме основная роль принадлежит углероду. Прокариоты способны воздействовать на любое известное углеродное соединение. В зависимости от источника углерода для конструктивного обмена все прокариоты делятся на две группы: автотрофы, к которым принадлежат организмы, способные синтезировать все компоненты клетки из углекислоты, и гетеротрофы, источником углерода для которых служат органические соединения.

Чтобы выяснить возможность развития бактерий за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, культуру высевают на среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди-, полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.

Использование соединений азота. Прокариоты могут усваивать азот органических соединений (мочевина, аминокислоты, пептоны, белки) и азот минеральных солей (соли аммония, нитраты). Некоторые бактерии могут фиксировать молекулярный азот.

Образование внеклеточных ферментов. Бактерии способны использовать в качестве питательных субстратов различные высокомолекулярные соединения: полисахариды, белки, нуклеиновые кислоты и т. д. Однако макромолекулы не могут проникать через мембрану клетки. Они подвергаются гидролизу, который осуществляется под воздействием экзоферментов, относящихся к классу гидролаз. Большинство из них катализирует гидролиз полимеров до растворимых продуктов (димеров или мономеров), которые поступают в клетку с помощью специфических транспортных систем.

Восстановление нитратов. Восстанавливать нитраты до нитритов способны микроорганизмы, образующие мембраносвязанный фермент нитратредуктазу. Нитрат служит конечным акцептором электронов дыхательной цепи у многих прокариот в отсутствии молекулярного кислорода. Процесс восстановления нитрата до нитрита в системе энергетического метаболизма называется нитратным дыханием.