Малый практикум по микробиологии (стр. 3 )

Микроскопия с фазово-контрастным устройством

Большим достижением в развитии методов визуализации микробных клеток стало изобретение Цернике в 1934 г. фазово-контрастной микроскопии и разработка этого вида микроскопии Кёллером и Лузом. Микроскопия с фазово-контрастным устройством основана на том, что с помощью этого устройства различия в фазе световых лучей при прохождении их через прозрачные объекты превращаются в амплитудные, в результате чего объекты становятся контрастными. Глаз человека выявляет различия в длине волны (цвет) и ее амплитуде (интенсивность, яркость), но не в состоянии заметить смещение фазы. Клетки большинства микроорганизмов по плотности мало отличаются от окружающей среды. Амплитуда световой волны, проходящей через них, почти не меняется, поэтому клетки выглядят прозрачными. Основная ценность метода фазового контраста состоит в том, что он дает возможность наблюдать живые объекты, не прибегая к их фиксации и окрашиванию. Применение фазово-контрастного устройства не позволяет увеличить разрешающую способность микроскопа, но дает возможность увидеть прозрачные объекты более четко и даже выявить некоторые структуры в клетках крупных бактерий.

Оптическая система, используемая для получения фазового контраста, состоит из фазовой пластинки и кольцевой диафрагмы. Фазовая пластинка расположена в задней фокальной плоскости объектива и представляет собой прозрачный диск, на котором напылено кольцо из металлов. Кольцевая диафрагма расположена под конденсором и представляет собой прозрачную щель в виде кольца на непроницаемой для света пластинке. Световая волна, проходя через клетки микроорганизмов, отстает по фазе примерно на ¼ λ относительно прямых волн, прошедших только через окружающую среду. В объективе микроскопа эти две волны интерферируют. Результирующая волна имеет ту же длину и амплитуду, что и прямая, но несколько отличается от нее по фазе. Для превращения разности фаз в разность амплитуд служит фазовая пластинка, которая дополнительно сдвигает дифрагированный луч на ¼ λ (рис. 4). Фазовый эффект создается в результате интерференции прямых лучей, не отклонившихся при прохождении через препарат, и боковых, дифрагированных лучей, которые благодаря прохождению через объект и через фазовую пластинку либо совпадают по фазе с прямыми, либо сдвинуты относительно них на ½ λ, т. е. находятся в противофазе. Дифракционная волна вычитается из прямой, в результате объект выглядит более темным. Кроме того, кольцевая диафрагма уменьшает интенсивность центрального светового пучка, что также усиливает контрастность.

Наиболее распространенной моделью фазово-контрастного устройства является КФ-4 (рис. 5). Фазово-контрастное устройство представляет собой приставку к микроскопу, состоящую из вспомогательного окуляра, специальных фазовых объективов и конденсора с набором кольцевых диафрагм, каждая из которых соответствует фазовой пластинке определенного объектива. Кольцевые диафрагмы установлены в револьверном диске под конденсором и поворотом диска могут легко меняться, при этом в окне крышки диска появляется цифра, соответствующая увеличению применяемого объектива. Кроме того, в револьверном диске имеется свободное отверстие – «нулевая диафрагма» – для наблюдений обычным способом. Конденсор снабжен двумя винтами для центрировки кольцевой диафрагмы относительно фазового кольца объектива. Все фазовые объективы имеют на оправе обозначение «ф».

Рис. 4. Схема хода лучей при использовании фазово-контрастного устройства:

1 — кольцевая диафрагма; 2 — конденсор; 3 — объект; 4 — объектив; 5 — фазовая пластинка

Рис. 5. Фазово-контрастное устройство КФ-4:

/ — конденсор; 2 — револьверный диск с набором кольцевых диафрагм; 3 — центри - ровочные винты; 4 — вспомогательный мик­роскоп; 5 — набор фазовых объективов

Порядок работы с фазово-контрастным устройством

1. Вместо обычного конденсора устанавливают фазово-контрастный. Диск револьвера конденсора поворачивают таким образом, чтобы в окошке стояла цифра «0». Ирисовая диафрагма должна быть полностью открыта.

2. Устанавливают объектив 90×ф.

3. Обычный окуляр заменяют на вспомогательный и, перемещая его тубус, добиваются четкой фокусировки фазовой пластинки объектива. Она имеет вид темного кольца.

4. Поворотом диска револьвера устанавливают кольцевую диафрагму, соответствующую объективу 90×ф. Теперь под микроскопом видно не только фазовое кольцо, но и светлое кольцо – щель диафрагмы.

5. Пользуясь центрировочными винтами конденсора, перемещают кольцевую диафрагму так, чтобы она совместилась с фазовым кольцом (рис. 6).

Рис. 6. Центрировка кольцевой ди­афрагмы и фазовой пластинки:

А — неправильное положение; Б — правильное положение

6. Вспомогательный окуляр заменяют обычным и фокусируют препарат.

Примечание: при микроскопировании с другими объективами устанавливают соответствующие кольцевые диафрагмы, и каждый раз проверяют центрировку, пользуясь вспомогательным окуляром.

Микроскопия в темном поле

Микроскопия в темном поле основана на освещении объекта косыми лучами света. Эти лучи не попадают в объектив, поэтому поле зрения выглядит темным. Если препарат содержит клетки микроорганизмов, то косые лучи, проходя через такой препарат, в значительной степени отражаются от поверхности клеток и настолько уклоняются от своего первоначального направления, что попадают в объектив. Тогда на черном фоне видны интенсивно светящиеся объекты. Такое освещение препарата достигается применением специального темнопольного конденсора (рис. 7).

Рис. 7. Конденсор темного поля ОИ-13

Конденсор темного поля имеет затемненную среднюю часть, поэтому центральные лучи света, идущие от осветителя, задерживаются, а в плоскость препарата попадают только боковые лучи, отраженные от зеркальных поверхностей, расположенных внутри конденсора (рис. 8).

Рис. 8. Схема хода лучей в конденсоре темного поля:

1 – линза конденсора, 2 – черная пластинка, задерживающая центральные лучи, 3 - объектив

При микроскопировании в темном поле можно увидеть объекты, величина которых измеряется сотыми долями микрометра, т. е. лежит за пределами видимости обычного микроскопа. Однако наблюдение объектов в темном поле позволяет различить только их контуры, но не дает возможность рассмотреть внутреннее строение.

Порядок работы с темнопольным конденсором

Для исследования готовят препарат «раздавленная капля» на стекле толщиной не более 1,2 мм, так как конденсоры темного поля имеют маленькое рабочее расстояние.

1. Вынимают светлопольный конденсор и устанавливают конденсор темного поля.

2. Наносят на верхнюю линзу конденсора каплю иммерсионного масла.

3. Устанавливают на предметном столике микроскопа препарат и закрепляют его клеммами.

4. Поднимают конденсор до соприкосновения иммерсионного масла с предметным стеклом. Капля должна равномерно заполнить пространство между линзой конденсора и предметным стеклом и не содержать пузырьков воздуха.

5. Глядя в окуляр, центрируют конденсор. Для этого с помощью регулировочных винтов приводят точно в центр поля зрения изображение светлого кольца с темным пятном в середине или только светлого пятна.

6. Устанавливают иммерсионный объектив 90×. Предварительно в выходной зрачок объектива следует поместить диафрагму, входящую в комплект конденсора, для снижения апертуры объектива до 0,85.

7. На препарат наносят каплю иммерсионного масла и фокусируют.

При правильной установке темнопольного конденсора в поле зрения должен наблюдаться эффект темного поля – ярко светящиеся частицы объекта на темном фоне.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности многих веществ биологического происхождения и красителей светиться под воздействием падающего на них света. Молекулы веществ, способных к люминесценции, поглощают энергию падающего света и переходят в возбужденное состояние, которое характеризуется более высоким энергетическим уровнем. В таком состоянии они находятся непродолжительное время и вновь возвращаются к исходному энергетическому уровню. Этот переход сопровождается отдачей избытка энергии в виде света – люминесценцией. Как правило, для возбуждения люминесценции объект освещают ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 300-400 нм или сине-фиолетовыми лучами с длиной волны 400-460 нм.

Ряд веществ биологического происхождения – хлорофилл, каротиноиды, порфирины, витамин В12, алкалоиды и другие соединения обладают собственной (первичной) люминесценцией. В зависимости от содержания таких веществ в клетке некоторым микроорганизмам, например, метанобразующим бактериям благодаря присутствию в их клетках кофермента F420, бактерии Pseudomonas aeruginosa, содержащей пигмент пиоцианин, свойственна первичная люминесценция.

Однако клетки большинства микроорганизмов люминесцируют очень слабо, поэтому их обрабатывают специальными красителями – флуорохромами, обладающими люминесценцией. Люминесценцию объекта после обработки флуорохромами называют наведенной или вторичной. К флуорохромам относятся акридин оранжевый, примулин, 4,6-диамидинофенилиндол (ДАФИ), флуорескамин, диацетилфлуоресцеин и другие. Флуорохромы применяются в виде сильно разбавленных водных растворов (1:500 – 1:100000). Такие растворы малотоксичны, что дает возможность изучать живые клетки. Флуорохромы могут окрашивать не только всю микробную клетку, но избирательно концентрироваться на определенных клеточных структурах, вызывая их свечение. Например, ДАФИ связывается с ДНК, что позволяет визуализировать область локализации ДНК внутри клеток, флуорескамин выявляет аминогруппы. Калькофлуор белый образует соединения с хитином, целлюлозой и используется для учета грибов в почве. Диацетилфлуоресцеин выявляет живые клетки.