Малый практикум по микробиологии (стр. 19 )

Отношение к молекулярному кислороду. По отношению к молекулярному кислороду выделяют группы облигатных аэробов и микроаэрофилов, факультативных, аэротолерантных и облигатных анаэробов. Принадлежность исследуемой культуры к той или иной группе можно выявить при росте культуры, посеянной уколом в среды Гисса.

Задание 1. Посеять исследуемую культуру на чашку Петри с РПА истощающим штрихом.

Истощающий посев используют для получения изолированных колоний. Для получения поверхностных колоний стерильной петлей берут небольшое количество бактериальной массы со скошенного РПА в пробирке и проводят посев по схеме, указанной на рисунке 43.

Рис. 43. Схема рассева культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды петлей

Задание 2. Посеять исследуемую культуру в мясо-пептонный бульон (МПБ).

Посев проводят стерильной бактериальной петлей в пробирки с 5 мл МПБ.

Задание 3. Для изучения физиолого-биохимических свойств посеять исследуемую культуру в следующие среды:

1. Среда Гисса с сахарами и индикатором ВР. Посев производят уколом в столбик питательной среды, погружая бактериальную иглу на ¾ высоты столбика среды. Рост бактерий на средах с углеводами часто сопровождается накоплением органических кислот, нейтральных продуктов, газов. Образование кислот регистрируют по изменению рН среды.

2. МПБ. Для выявления способности исследуемой культуры продуцировать аммиак и сероводород осуществляют посев в пробирки с 5 мл МПБ. МПБ – это белковая среда, которую готовят на основе мясной воды с добавлением 1 % пептона (продукт неполного разложения белка, содержит смесь полипептидов) и 0,5 % NaCl. Разложение белка (аммонификация) сопровождается образованием побочных продуктов. Аммиак выделяется при дезаминировании аминокислот, сероводород – при разрушении серусодержащих аминокислот (цистина, цистеина, метионина). После посева для обнаружения аммиака под ватной пробкой укрепляют стерильную полоску лакмусовой бумаги, для выявления сероводорода – полоску бумаги, пропитанную раствором уксуснокислого свинца (рис. 44). Пробки засеянных пробирок заворачивают целлофаном, чтобы затруднить улетучивание аммиака и сероводорода.

Рис. 44. Обнаружение сероводорода:

1- почернение свинцовой бумаги, 2 – образование FeS в толще среды

3. Молоко и мясо-пептонная желатина. Протеолитические ферменты (протеазы) катализируют расщепление белков на фрагменты: поли- и олигопептиды. Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качестве субстрата желатину, казеин или другие белки. Для обнаружения фермента коллагеназы культуру высевают в пробирки с 5 мл мясо-пептонной желатины (МПЖ). Посев проводят уколом. Для выявления способности образовывать фермент казеиназу культуру высевают в пробирки с 5 мл обезжиренного молока. Посев осуществляют петлей.

4. МПБ с 0,2 % KNO3. Способность к восстановлению нитратов выявляют при посеве культуры в пробирки с 5 мл среды, состоящей из МПБ и 0,2 % KNO3. Посев проводят петлей.

Все посевы инкубируют в термостате при температуре 30 °С в течение 7 суток. Пробирки с МПЖ оставляют при комнатной температуре.

Материалы и оборудование. Спиртовка, бактериологическая петля, пинцет, чашки Петри с РПА, пробирки с МПБ, пробирки со средой Гисса, пробирки с МПЖ, пробирки с молоком.

Вопросы:

1.  Что такое колония? Какими способами получают изолированные колонии?

2.  Какие среды использовали для выявления способности использовать углеводы как источник углерода?

3.  Каким образом определяют способность культуры продуцировать аммиак и сероводород?

4.  Как изучают способность бактерий к восстановлению нитратов?

5.  Как определить активность внеклеточных протеаз?

ТЕМА 10. ИДЕНТИФИКАЦИЯ БАКТЕРИЙ (ПРОДОЛЖЕНИЕ)

Занятие 12

Регистрация результатов

Задание 1. Описать рост идентифицируемой бактерии на РПА:

А) описать колонии, учитывая следующие признаки:

форму колонии – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т. д. (рис. 45);

размер (диаметр) колонии измеряют в мм; если размеры колоний не превышают 1 мм, то их называют точечными;

поверхность колонии – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

профиль колонии – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т. д. (рис. 46);

блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая, прозрачная;

цвет колонии – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или пигментированная – белая, желтая, золотистая, оранжевая, сиреневая, красная, черная и т. д., отмечают выделение пигмента в субстрат;

край колонии – ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д. (рис. 47);

структуру колонии – однородная, мелко - или крупнозернистая, струйчатая и т. д. (рис. 48);

консистенцию колонии определяют, прикасаясь к ее поверхности петлей. Колония может легко сниматься с агара, быть плотной, мягкой или врастающей в агар, слизистой, пленчатой, хрупкой.

Б) описать характер роста микроорганизма по штриху, учитывая:

интенсивность роста – скудный, умеренный или обильный;

особенности роста – налет сплошной с ровным или волнистым краем, четковидный в идее цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоидный (рис. 49);

оптические свойства, цвет штриха, поверхность, консистенцию.

Рис. 45. Форма колоний:

1 – круглая, 2 – круглая с фестончатым краем, 3 – круглая с валиком по краю, 4, 5 – ризоидные, 6 – с ризоидным краем, 7 – амебовидная, 8 – нитевидная, 9 – складчатая, 10 – неправильная, 11 – концентрическая, 12 - сложная

Рис. 46. Профиль колонии: 1 – изогнутый, 2 – кратерообразный, 3 – бугристый,

4 – врастающий в субстрат, 5 – плоский, 6 – выпуклый, 7 – каплевидный, 8 - конусовидный

Рис. 47. Край колонии: 1 – гладкий, 2 – волнистый, 3 – зубчатый. 4 – лопастной.

5 – неправильный, 6 – реснитчатый, 7 – нитчатый, 8 – ворсинчатый, 9 – ветвистый

Рис. 48. Структура колонии: 1 – однородная, 2 – мелкозернистая,

3 – крупнозернистая, 4 – струйчатая, 5 – волокнистая

Рис. 49. Рост бактерий по штриху:

1 – сплошной с ровным краем, 2 – сплошной с волнистым краем,

3 - четковидный, 4 – диффузный, 5 – перистый, 6 - ризоидный

Задание 2. Описать характер роста исследуемой культуры в МПБ.

Характеризуя рост культуры в МПБ, отмечают его интенсивность: скудный, умеренный или обильный. Помутнение среды может быть однородным, хлопьевидным или с шелковистой волнистостью. Если образуется пленка, указывают ее особенности: кольцеобразная или сплошная, тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, сухая или слизистая, всползающая или опадающая. При образовании осадка указывают – скудный он или обильный, плотный или рыхлый, слизистый или хлопьевидный.

Задание 3. Учесть результаты опытов по изучению физиолого-биохими-ческих свойств исследуемой культуры.

Использование углеводов. Рост или его отсутствие на средах Гисса с углеводами определяют по помутнению среды, образованию пленки или осадка. Изменение цвета индикатора указывает на образование кислых или щелочных продуктов. В кислой среде индикатор ВР (водный голубой и розоловая кислота), входящий в состав среды, имеет синий цвет. При подщелачивании, происходящем за счет разложения пептона, отмечается покраснение среды. Результаты наблюдений сравнивают со стерильной средой. Полученные сведения оформляют в виде таблицы 5:

Таблица 5

Показатели роста исследуемой культуры на средах с углеводами

Углевод	Характер роста	рН среды
подкисление	подщелачивание	без изменения
Глюкоза
Сахароза
Лактоза

Использование соединений азота. При развитии культуры в МПБ источниками азота являются органические азотсодержащие соединения (белки, пептоны). В процессе аммонификации белки и пептоны разлагаются до аминокислот, которые далее подвергаются дезаминированию с выделением аммиака, при разрушении серусодержащих аминокислот продуцируется сероводород. Процесс аммонификации всегда сопровождается повышением щелочности среды. При образовании аммиака красный лакмус синеет. Выделение сероводорода обнаруживают по почернению бумаги вследствие образования сульфида свинца.

Образование внеклеточных ферментов

Протеолиз желатины. При образовании исследуемой бактерий фермента коллагеназы происходит разжижение желатины. Указывают интенсивность и форму разжижения. Разжижение бывает послойным, воронкообразным мешковидным, пузырчатым (рис. 50).